一种人源生物角膜基质的制备方法和应用技术

本发明专利技术公开了一种人源生物角膜基质的制备方法，它由人源角膜溶液和

【技术实现步骤摘要】
一种人源生物角膜基质的制备方法和应用


[0001]本专利技术属于组织工程和再生医学领域，具体涉及一种人源生物角膜基质的制备方法和应用
。

技术介绍

[0002]中国角膜病致盲者约
500
万，仅次于白内障，居眼科致盲疾病的第二位，约
80
％的患者可通过角膜移植恢复视力
。
但由于我国传统观念和眼库条件的限制，人供体角膜严重短缺，仅少数患者从中获益
。
同时，我国每年完成角膜屈光手术约
100
万例，激光切割取下的人角膜基质片，绝大多数情况下被作为医疗废物丢弃
。
这主要是因为植片尺寸过小很难满足常规角膜移植的供体需求
。
利用角膜屈光手术废弃的人角膜基质进行重构，制备一种满足常规角膜移植手术需求的供体植片是一种吸引人的方法
。
中国专利技术专利（申请号
202010815050.0
）公开了一种脱细胞人源角膜基质的制备方法
。
该专利技术将全飞秒激光屈光矫正手术的人角膜基质透镜进行脱细胞处理，得到具有良好的透明度的人角膜基质
。
但该专利技术未改变人角膜透镜的尺寸问题，过小的植片尺寸很难满足角膜移植的需求
。

技术实现思路

[0003]为解决现有技术的不足，本专利技术一方面提供了一种人源生物角膜基质的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
a
）制备人角膜基质溶液
、b
）制备聚乙二醇双丙烯酸酯（
PEGDA
）角膜基质骨架
、c
）将人角膜基质溶液浸入并固定到
PEGDA
角膜基质骨架中；
[0004]其中，步骤
a
）进一步包括如下步骤：
[0005]（
a1
）将人角膜基质浸泡在含有
300
‑
800U/ml
脱氧核糖核酸酶的
0.1
‑
0.5% 脱氧胆酸钠溶液中1‑5小时，随后用
PBS
缓冲液清洗，得到脱细胞人角膜基质；
[0006]本专利技术对人角膜基质的种类
、
状况和来源不作限制，包括天然人源组织溶液及其衍生物，例如人角膜溶液
、
脱细胞人角膜溶液
、
甲基丙烯酰化人源细胞外基质溶液
。
角膜基质可以是完整的
、
不完整的
、
破损的，来源于供体角膜
、
角膜屈光手术取下的人角膜基质透镜
、
角膜移植手术剩余的角膜环
、
人角膜脱细胞基质中的一种或多种混合材料
。
[0007]脱细胞溶液的制备采用常规方法即可
。
[0008]在一种优选的实施方式中，脱氧核糖核酸酶的浓度为
500U/ml
；脱氧胆酸钠溶液的浓度为
0.2% 。
[0009]在一种优选的实施方式中，还可以加入1‑
2%
曲拉通
‑
100
或
0.5%
‑
1%
的十二烷基硫酸钠或
0.1%
‑
0.5%
月桂酰基氨基酸；或加入
1%
‑
5%
的右旋糖酐
‑
400
和
1%
‑
3%
的硫酸软骨素，防止角膜组织在脱细胞过程中过度溶胀
。
[0010]本专利技术中，在上述浸泡（浸入）过程中，可以同时采用超声
、
抽真空或搅拌的方式加速浸泡或浸入的过程
。
[0011]在一种优选的实施方式中，浸泡步骤为将人源角膜浸入至少
10
倍体积量的脱细胞溶液的混合液中，置于恒温摇床，
37℃
，
120
转
/
分钟处理2‑4小时
。
[0012]（
a2
）将脱细胞人角膜基质冷冻干燥后称重，以1‑
10%
的质量体积比，浸泡到胃蛋白酶溶液或胶原酶溶液中
24
‑
72
小时；
[0013]所述胃蛋白酶溶液的浓度为1‑
5g/ml
，优选为
3g/ml。
[0014]在一种优选的实施方式中，所述胃蛋白酶溶液是用
0.1N
的盐酸溶液配置的
。
[0015]所述胶原酶溶液，浓度为
200
‑
1000U/ml。
[0016]在一种优选的实施方式中，所述质量体积比为3‑
5%
，更优选为
3%。
[0017]本专利技术中，在上述浸泡（浸入）过程，优选在
20
‑
38℃
条件下完成；可以同时采用超声
、
抽真空或搅拌的方式加速浸泡或浸入的过程
。
[0018]在一种优选的实施方式中，所述浸泡过程还包括将溶液置于摇床
120
转
/
分钟，处理
12
‑
36
小时，直至角膜组织完全消化；或将溶液置于加有磁性转子的烧杯中，置于磁力搅拌器上以
200
‑
500
转每分钟，搅拌
12
‑
24
小时，直至角膜组织完全消化
。
[0019]（
a3
）加入碱性溶液中和，搅拌直至溶液的
PH
值为
6.8
‑
8.0
，溶液恢复透明，得到人角膜基质溶液；
[0020]在一种优选的实施方式中，所述碱性溶液为
1N
的
NaOH
，加入量为脱细胞人角膜基质溶液体积的
1/10
；搅拌直至溶液的
PH
值为
7.0
‑
7.6。
[0021]或（
a3
）将（
a2
）制备的人角膜基质溶液，置于冻干机中冻干，然后用磷酸盐缓冲液溶解，得到浓度为
1%
‑
10%
的脱细胞人角膜基质溶液；
[0022]所述冻干的条件为：温度
‑
50℃、
真空度为
500 mTorr
的条件下冻干
12
‑
36
小时
。
[0023]步骤
b
）可通过两种方式制备，第一种是通过角膜模具制备，包括将
PEGDA
灌入角膜模具中，通过
365nm
紫外光源照射后得到
PEGDA
角膜基质骨架
。
第二种包括将
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【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.
一种人源生物角膜基质的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
a
）制备人角膜基质溶液
、b
）制备聚乙二醇双丙烯酸酯（
PEGDA
）角膜基质骨架
、c
）将人角膜基质溶液浸入并固定到
PEGDA
角膜基质骨架中；其中，步骤
a
）包括如下步骤：（
a1
）将人角膜基质浸泡在含有
300
‑
800U/ml
脱氧核糖核酸酶的
0.1
‑
0.5% 脱氧胆酸钠溶液中1‑5小时，随后用
PBS
缓冲液清洗，得到脱细胞人角膜基质；（
a2
）将脱细胞人角膜基质冷冻干燥后称重，以1‑
10%
的质量体积比，浸泡到胃蛋白酶溶液或胶原酶溶液中
24
‑
72
小时；（
a3
）加入碱性溶液中和，搅拌直至溶液的
PH
值为
6.8
‑
8.0
，溶液恢复透明，得到人角膜基质溶液；或将（
a2
）制备的人角膜基质溶液，置于冻干机中冻干，然后用磷酸盐缓冲液溶解，得到浓度为
1%
‑
10%
的脱细胞人角膜基质溶液；所述冻干的条件为：温度
‑
50℃、
真空度为
500 mTorr
的条件下冻干
12
‑
36
小时；步骤
b
）包括：通过角膜模具制备，包括将
PEGDA
灌入角膜模具中，通过
365nm
紫外光源照射后得到
PEGDA
角膜基质骨架；或包括将
PEGDA
浸入到角膜基质中，并通过光激活或温度激活将其固化在角膜基质内部；随后通过
10
‑
25%
的盐酸浸泡，去除角膜中的生物组分，保留
PEGDA
角膜基质骨架；步骤
c
）包括如下步骤：（
c1
）将步骤
b
）得到的
PEGDA
角膜基质骨架浸泡到步骤
a
）得到的人角膜基质溶液中，抽真空6‑
24
小时；（
c2
）取出
PEGDA
角膜基质骨架，去除表面溶液，静置
20
‑
60
分钟；（
c3
）将
PEGDA
角膜基质骨架浸泡于交联剂中至少
10
分钟，得到人源生物角膜基质
。2.
如权利要求1所述的制备方法，其特征在于：步骤（
a1
）中，所述脱氧核糖核酸酶的浓度为
500U/ml
，所述脱氧胆酸钠溶液的浓度为
0.2%
；所述浸泡为将人源角膜浸入至少
10
倍体积量的脱细胞溶液的混合液中；步骤（
a2
）中，所述质量体积比为3‑
5%
，所述浸泡过程还包括将溶液置于摇床
120
转
/
分钟，处理
12
‑
36
小时，直至角膜组织完全消化；或将溶液置于加有磁性转子的烧杯中，置于磁力搅拌器上以
200
‑
500
转每分钟，搅拌
12
‑
24
小时，直至角膜组织完全消化；步骤（
a3
）中，所述
PH
值为
7.0
‑
7.6。3.
如权利要求1所述的制备方法，其特征在于：步骤
b
）包括如下步骤：（
b1
）刮除新鲜角膜上皮和内皮，
PBS
缓冲液冲洗干净，得到角膜基质；（
b2
）将角膜基质浸泡到
30
‑
100
倍体积量的
0.05
‑
0.5g/ml PEGDA
溶液中
18
‑
48
小时；（
b3
）取出角膜基质并通过光激活或温度激活，使
PEGDA
完全...

【专利技术属性】
技术研发人员：赵龙，史伟云，周庆军，王婷，史真，王付燕，
申请(专利权)人：山东第一医科大学附属眼科研究所山东省眼科研究所，
类型：发明
国别省市：