融合双链制造技术

本发明专利技术公开了一种融合双链

【技术实现步骤摘要】
融合双链DNA结合蛋白Sto7dm的Taq DNA聚合酶及其制备方法与应用


[0001]本专利技术属于生物技术领
，具体涉及一种融合双链
DNA
结合蛋白
Sto7dm
的
Taq DNA
聚合酶及其制备方法与应用
。

技术介绍

[0002]TaqMan
探针法
qPCR
是在传统
PCR
的基础上加入
TaqMan
荧光探针进行荧光检测的方法，
TaqMan
荧光探针两端分别标记有一个报告荧光基团和一个猝灭荧光基团，探针完整时不产生荧光
。
当探针与模板结合，通过
Taq DNA
聚合酶的
5'
‑
3'
核酸外切酶活性将探针酶切，使报告荧光基团和猝灭荧光基团分离，从而产生荧光
。
因此，通过检测
PCR
反应体系中的荧光信号强度可以实时监测整个
PCR
扩增过程，最后利用标准曲线对未知模板实现定量分析
。
这种检测方法特异性强
、
灵敏度高
、
易重复，目前已广泛应用于生物科学研究
、
环境监测
、
食品安全检测
、
临床诊断等领域
。
[0003]尽管探针法
qPCR
技术被认为是众多核酸检测领域的“金标准”，但其检测流程繁琐
、/>耗时长，限制了其在快速诊断应用场景的灵活性，且在核酸提取过程中容易出现样本间核酸交叉污染和核酸损失等问题
。
[0004]针对传统
qPCR
技术的耗时和实验室依赖型等局限，研究学者就
qPCR
技术的检测仪器
、
检测方法
、
反应体系等方面作出大量研究
。
比如现有的全自动分子诊断检测系统，该系统集样本处理
、
核酸提取
、qPCR
扩增
、
检测为一体，可在
45min
内得到检测结果，但是目前这个系统仍然存在成本高的问题，主要用在一些特殊的项目上
。
国内学者开发的基于微流控芯片技术的超快
PCR
系统在同样能满足快速检测的需求，其中微流体的小型化设计具备更快的热导率，可在
40min
内完成检测，而且可兼容多个荧光通道同时检测，大大提高了检测通量，但是超快
PCR
模式会损失一定的检测敏感性且对
DNA
的延伸性能有要求
。
不依赖超快
PCR
仪器或全自动技术，采用省略核酸提取过程的直扩
qPCR
方法同样备受关注，这种方法不仅节省了核酸提取成本，缩短了样本结果检出时间，而且避免了在核酸提取过程中出现的核酸损失或降解等问题
。
然而，直扩
qPCR
所使用的粗样本中存在
PCR
抑制剂，这些抑制剂会严重影响
DNA
聚合酶的活性，从而影响检测结果
。
通常来说，理想的直扩体系包括酶
、
缓冲液
、Mg
2+
、dNTPs、
增强剂
、
稳定剂等诸多因素
。
其中改善直扩
qPCR
的关键是使用具有高耐抑制剂性能的
DNA
聚合酶
。
[0005]综上所述，传统
qPCR
技术固有的一些缺点，比如检测流程的繁琐或对于复杂样本中某些抑制成分的高灵敏度，限制了
qPCR
技术进一步的发展，开发更加强大的
qPCR
检测平台是克服这些问题的一种可能的解决方案
。
因此，无论是结合微流控技术的超快
PCR
还是直扩方法的提出，都推动了
TaqMan
探针法
qPCR
技术朝着快速
、
准确
、
高通量
、
低成本的方向发展
。
而
DNA
聚合酶作为
qPCR
技术的核心组分，其性能优劣直接影响
qPCR
技术的进一步发展
。
[0006]Taq DNA
聚合酶作为
TaqMan
探针法
qPCR
技术的指定用酶，具有良好的热稳定性及探针切割活性，但是野生型
Taq DNA
聚合酶存在一些缺点，比如抑制剂耐受性差，如植物核
酸样本中的多糖
、
血液核酸样本中的免疫球蛋白
、
土壤核酸样本中的腐殖酸等抑制剂都会抑制
Taq DNA
聚合酶活性
。
另外，野生型
Taq DNA
聚合酶在最适温度时的延伸速率为
1kb/min
，缩短延伸时间会对其扩增效率产生负面影响
。2004
年，
Wang
等人将双链
DNA
结合蛋白
Sso7d
融合在全长
Taq
酶和
Stoffel
片段的
N
端，显著提高了聚合酶的延伸性能和盐离子耐受性
。Wang
等人认为双链
DNA
结合蛋白对
DNA
亲和力的大小会影响
DNA
聚合酶的催化活性
。DNA
亲和力过高，可能会对聚合酶的催化活性有负面影响；
DNA
亲和力过低，又可能不会显着增强聚合酶的持续性
。
因此，需要进一步的研究来确定双链
DNA
结合蛋白的最佳性能范围，以实现持续性和催化性之间的最终平衡
。
但是，
Wang
等人并没有研究
S
‑
Taq
改造体在
TaqMan
探针法
qPCR
体系中的性能及应用，
Sso7d
与
Taq
酶的融合位置也只研究了
N
端，缺少对其他融合位置的对比研究
。
[0007]综上所述，研究开发一种用于快速或直扩
TaqMan
探针法
qPCR
的高性能
Taq DNA
聚合酶，对于
TaqMan
探针法
qPCR
技术的发展具有重要意义
。

技术实现思路

[0008]为克服野生型
Taq DNA
聚合酶的延伸性能不足和抑制剂耐受性差的问题，同时保证野生型
...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.
一种融合双链
DNA
结合蛋白
Sto7dm
的
Taq DNA
聚合酶，其特征在于：命名为
Taq
‑
Sto
，其氨基酸序列如
SEQ ID NO.1
所示
。2.
一种核酸分子，其特征在于：所述的核酸分子包括编码权利要求1中所述的
Taq
‑
Sto
的
DNA
片段
。3.
一种表达载体，其特征在于：所述的表达载体包括权利要求2中所述的核酸分子
。4.
一种宿主细胞，其特征在于：所述的宿主细胞包括权利要求3中所述的表达载体
。5.
权利要求1中所述的融合双链
DNA
结合蛋白
Sto7dm
的
Taq DNA
聚合酶的制备方法，所述的制备方法包括以下步骤：
S1、
将权利要求3中所述的表达载体转化到感受态细胞中，冰浴后热休克，在冰上冷却复苏，加入
LB
液体培养基进行恒温振荡培养，挑取单克隆细胞进行筛选；
S2、
提取筛选的阳性克隆的表达载体，转化到宿主细胞，并将宿主细胞接种于
LB
液体培养基，进行恒温振荡培养，获得含有
Taq
‑
Sto
的种子培养液；
S3、
取所述的种子培养液接种于
LB
液体培养基中，进行放大培养，获得含有
Taq
‑
Sto
的菌液；
S4、
向所述的菌液中加入
IPTG
诱导宿主细胞表达
Taq
‑
Sto
，离心，获得含有
Taq
‑
Sto
的菌体沉淀；
S5、
向所述的菌体沉淀中加入裂解缓冲液，重悬含有
Taq
‑
Sto
的菌体，通过超声破碎所述菌体，离心，获得含有
Taq
‑
Sto
的破碎菌体上清液；
S6、
将所述的破碎菌体上清液通过恒温孵育
、
离心去除杂质蛋白，获得含有
Taq
‑
Sto
的蛋白上清液；
S7、
将所述的蛋白上清液进行镍离子亲和层析，利用洗脱缓冲液进行梯度洗脱，形成层析洗脱液，取所述层析洗脱液进行蛋白变性，利用
SDS
‑
PAGE
电泳方法检测所述层析洗脱液，收集含有
Taq
‑
Sto
的层析洗脱液，即获得所述的
Taq
‑
Sto。6.
一种
TaqMan
探针法
qPCR
反应试剂盒，其特征在于：所述试剂盒包含权利要求1中所述的融合双链

【专利技术属性】
技术研发人员：胡松青，袁家惠，刘光毅，侯轶，
申请(专利权)人：华南理工大学，
类型：发明
国别省市：