嘌呤核苷磷酸化酶突变体及制造技术

本发明专利技术提供了一种嘌呤核苷磷酸化酶突变体及

【技术实现步骤摘要】
嘌呤核苷磷酸化酶突变体及2'
‑
氟代核苷的制备方法


[0001]本专利技术涉及酶催化领域，具体而言，涉及一种嘌呤核苷磷酸化酶突变体及
2'
‑
氟代核苷的制备方法
。

技术介绍

[0002]生物转化法合成核苷及其类似物，可以利用核苷磷酸化酶将廉价的核苷转化为高附加价值的核苷，相较于化学法合成，反应条件温和，产品单一且对环境友好
。
其中，核苷磷酸化酶包括嘧啶核苷磷酸化酶（
pyrimidine nucleoside phosphorylase
，
PyNP
）和嘌呤核苷磷酸化酶（
purine nucleoside phosphorylase
，
PNP
）等，是参与嘧啶和嘌呤代谢途径中的酶，可以可逆的催化核苷的磷酸水解反应，因而可以协同作用被用于嘌呤核苷及其类似物的生物合成
。
如可以采用一锅法利用
PyNP
和
PNP
催化
2'
‑
脱氧尿苷和腺嘌呤来生产
2'
‑
脱氧腺苷
。
其中，
PyNP
可以将
2'
‑
脱氧尿苷分解成
2'
‑
脱氧核糖
‑1‑
磷酸和尿嘧啶（
Uracil
），另一底物腺嘌呤和
PyNP
催化生成的
2'
‑
>脱氧核糖
‑1‑
磷酸可以被
PNP
合成
2'
‑
脱氧腺苷
。
[0003]然而，对于核苷类似物如
2'
‑
氟
‑
2'
‑
脱氧腺苷的生物合成，由于其底物
2'
‑
氟
‑
2'
‑
脱氧尿苷为非天然底物，野生型
PyNP
和
PNP
的催化活性则比较低，因而限制了利用生物法来合成
2'
‑
氟修饰核苷单体的商业化生产
。Zhou
等人利用嗜热栖热菌（
Thermus thermophilus
）来源的野生型嘧啶核苷磷酸化酶（
TtPyNP
）和异常球菌属中度嗜热菌（
Deinococcus geothermalis
）来源的野生型嘌呤核苷磷酸化酶（
DgPNP
）反应
24 h
仅能获得低于
0.5 mM
的
2'
‑
氟
‑
2'
‑
脱氧腺苷（
Recombinant purine nucleoside phosphorylases from thermophiles: preparation, properties and activity towards purine and pyrimidine nucleosides
）
。
专利
CN111534493
公开了一种大肠杆菌来源的嘌呤核苷磷酸化酶（
EcPNP
）突变体，将
167
位的甲硫氨酸突变成精氨酸，第
168
位的苯丙氨酸突变成丙氨酸，其活性较野生型酶提高了
47.6%
，但利用该突变制备
2'
‑
氟
‑
2'
‑
脱氧腺苷的产量低于
1.5 mM
，无法满足规模化生产的需求
。

技术实现思路

[0004]本专利技术的主要目的在于提供一种嘌呤核苷磷酸化酶突变体及
2'
‑
氟代核苷的制备方法，以解决现有技术中酶催化合成
2'
‑
氟代核苷产量低的问题
。
[0005]为了实现上述目的，根据本专利技术的第一个方面，提供了一种嘌呤核苷磷酸化酶突变体，包括：（
a
）以
SEQ ID NO
：3所示的嘌呤核苷磷酸化酶野生型酶
GsPNP
为基础发生突变的蛋白，突变选自如下任意一种或多种突变：
L148、P19、Q41、T51、R56、T62、I69、S70、I73、T74、Q78、S79、Y80、N81、V82、Q83、A93、I94、K96、V98、K99、M107、T108、S109、S113、T119、Y125、A126、T128、N130、F131、K135、Y138、L142、K144、V150、S152、V153、F154、A156、F166、K168、A170、Y172、V174、L175、I205
或
L206
；或（
b
）与（
a
）中限定的氨基酸序列具有
70%
以上同源性且具有嘌呤核苷磷酸化酶活性的蛋白质
。
[0006]进一步地，（
a
）中，各位点取代的氨基酸的类型各自独立地选自如下：
L148P、P19M、
P19K、Q41D、Q41G、Q41N、Q41T、T51F、T51W、T51Y、R56K、T62C、I69M、S70G、I73A、I73G、I73L、T74Q、Q78A、Q78K、S79T、Y80A、Y80P、Y80T、N81G、V82A、Q83G、A93S、I94A、I94L、I94N、K96E、K96P、K96S、V98E、V98H、V98L、V98M、V98Q、V98S、V98T、K99S、M107E、M107G、M107H、M107N、M107S、M107Y、T108I、T108L、T108R、T108V、S109N、S113N、T119C、T119K、Y125F、Y125H、Y125K、Y125M、Y125Y、A126G、A126S、T128C、N130D、F131A、F131I、F131L、F131P、F131S、F131T、F131W、K135E、Y138S、Y138L、K142R、K144A、K144L、L148A、L148G、L148Q、L148S、L148Y、V150E、V150P、S152D、S152G、S152H、S152K、S152N、S152P、V153S、F154L、F154K、A156E、F166I、F166P、F166S、F166T、F166V、K168E、A170E、A170R、Y172A、Y172C、Y172G、Y172L、Y172N、Y172Q、Y172R、V174D、V174G、V174L、V174M、V174N、V174Q、V174S、V174T、L175A、L175E、L175G、L175K、L175N、L175S、L175T、I205A、I205V<本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.
一种嘌呤核苷磷酸化酶突变体，其特征在于，包括：（
a
）以
SEQ ID NO
：3所示的嘌呤核苷磷酸化酶野生型酶
GsPNP
为基础发生突变的蛋白，所述突变选自如下任意一种或多种突变：
L148、P19、Q41、T51、R56、T62、I69、S70、I73、T74、Q78、S79、Y80、N81、V82、Q83、A93、I94、K96、V98、K99、M107、T108、S109、S113、T119、Y125、A126、T128、N130、F131、K135、Y138、L142、K144、V150、S152、V153、F154、A156、F166、K168、A170、Y172、V174、L175、I205
或
L206
；或（
b
）与（
a
）中限定的氨基酸序列具有
70%
以上同源性且具有嘌呤核苷磷酸化酶活性的蛋白质
。2.
根据权利要求1所述的嘌呤核苷磷酸化酶突变体，其特征在于，所述（
a
）中，所述突变选自如下任意一种或多种突变：
L148P、P19M、P19K、Q41D、Q41G、Q41N、Q41T、T51F、T51W、T51Y、R56K、T62C、I69M、S70G、I73A、I73G、I73L、T74Q、Q78A、Q78K、S79T、Y80A、Y80P、Y80T、N81G、V82A、Q83G、A93S、I94A、I94L、I94N、K96E、K96P、K96S、V98E、V98H、V98L、V98M、V98Q、V98S、V98T、K99S、M107E、M107G、M107H、M107N、M107S、M107Y、T108I、T108L、T108R、T108V、S109N、S113N、T119C、T119K、Y125F、Y125H、Y125K、Y125M、Y125Y、A126G、A126S、T128C、N130D、F131A、F131I、F131L、F131P、F131S、F131T、F131W、K135E、Y138S、Y138L、K142R、K144A、K144L、L148A、L148G、L148Q、L148S、L148Y、V150E、V150P、S152D、S152G、S152H、S152K、S152N、S152P、V153S、F154L、F154K、A156E、F166I、F166P、F166S、F166T、F166V、K168E、A170E、A170R、Y172A、Y172C、Y172G、Y172L、Y172N、Y172Q、Y172R、V174D、V174G、V174L、V174M、V174N、V174Q、V174S、V174T、L175A、L175E、L175G、L175K、L175N、L175S、L175T、I205A、I205V
或
L206I ，其中，数字前字母代表原始氨基酸，数字后字母代表突变氨基酸
。3.
根据权利要求1所述的嘌呤核苷磷酸化酶突变体，其特征在于，所述突变包括如下任意一种氨基酸突变：
L148P+P19M、L148P+P19K、L148P+Q41D、L148P+Q41G、L148P+Q41N、L148P+Q41T、L148P+T51F、L148P+T51W、L148P+T51Y、L148P+R56K、L148P+T62C、L148P+I69M、L148P+S70G、L148P+I73A、L148P+I73G、L148P+I73L、L148P+T74Q、L148P+Q78A、L148P+Q78K、L148P+S79T、L148P+Y80A、L148P+Y80P、L148P+Y80T、L148P+N81G、L148P+V82A、L148P+Q83G、L148P+A93S、L148P+I94A、L148P+I94L、L148P+I94N、L148P+K96E、L148P+K96P、L148P+K96S、L148P+V98E、L148P+V98H、L148P+V98L、L148P+V98M、L148P+V98Q、L148P+V98S、L148P+V98T、L148P+K99S、L148P+M107E、L148P+M107G、L148P+M107H、L148P+M107N、L148P+M107S、L148P+M107Y、L148P+T108I、L148P+T108L、L148P+T108R、L148P+T108V、L148P+S109N、L148P+S113N、L148P+T119C、L148P+T119K、L148P+Y125F、L148P+Y125H、L148P+Y125K、L148P+Y125M、L148P+Y125Y、L148P+A126G、L148P+A126S、L148P+T128C、L148P+N130D、L148P+F131A、L148P+F131I、L148P+F131L、L148P+F131P、L148P+F131S、L148P+F131T、L148P+F131W、L148P+K135E、L148P+Y138S、L148P+Y138L、L148P+K142R、L148P+K144A、L148P+K144L、L148P+V150E、L148P+V150P、L148P+S152D、L148P+S152G、L148P+S152H、L148P+S152K、L148P+S152N、L148P+S152P、L148P+V153S、L148P+F154L、L148P+F154K、L148P+A156E、L148P+F166I、L148P+F166P、L148P+F166S、L148P+F166T、L148P+F166V、L148P+K168E、L148P+A170E、L148P+A170R、L148P+Y172A、L148P+Y172C、L148P+Y172G、L148P+Y172L、L148P+
Y172N、L148P+Y172Q、L148P+Y172R、L148P+V174D、L148P+V174G、L148P+V174L、L148P+V174M、L148P+V174N、L148P+V174Q、L148P+V174S、L148P+V174T、L148P+L175A、L148P+L175E、L148P+L175G、L148P+L175K、L148P+L175N、L148P+L175S、L148P+L175T、L148P+I205A、L148P+I205V、L148P+L206I、L148P+P19K+M107G、L148P+P19M+F166P、L148P+Q41G+T119K、L148P+Q41D+A156E、L148P+Q41N+K96E、L148P+Q41T+T51W、L148P+Q41T+N81G、L148P+Q41T+T108R、L148P+Q41T+L175K、L148P+T51F+F166I、L148P+T51W+V174S、L148P+T51Y+F166P、L148P+R56K+A126S、L148P+T62C+M107H、L148P+I69M+K135E、L148P+S70G+Y125H、L148P+I73A+S152N、L148P+I73A+M107Y、L148P+I73G+V98Q、L148P+T74Q+I94N、L148P+Q78A+V174S、L148P+Q78K+L175G、L148P+S79T+A93S、L148P+Y80A+F154L、L148P+Y80P+Y172A、L148P+Y80T+L206I、L148P+Q83G+S152D、L148P+V98E+V153S、L148P+V98L+V174L、L148P+V98M+F131I、L148P+V98H+K168E、L148P+V98S+Y172Q、L148P+M107S+S152K、L148P+T108L+V174D、L148P+T108V+L175K、L148P+S113N+S152H、L148P+T119C+S152G、L148P+Y125M+Y172L、L148P+A126G+Y172G、L148P+T128C+V174N、L148P+N130D+V150E、L148P+F131L+I205V、L148P+F131P+Y172C、L148P+F131W+L175S、L148P+Y138S+V174Q、L148P+F166S+V174M、L148P+F166V+L175E、L148P+P19K+T108V+Y125Y、L148P+P19M+M107N+F166P、L148P+Q41D+M107G+S152P、L148P+Q41N+Y80P+K144A、L148P+Q41T+M107H+V174L、L148P+Q41T+L175K+I73A、L148P+T51W+Y80P+V174S、L148P+T51Y+F131T+V174G、L148P+R56K+Q78A+F166S、L148P+T62C+Y125K+V150P、L148P+I73A+T108L+F131S、L148P+I73G+K96P+S152H、L148P+I73L+V98M+F166P、L148P+V82A+A93S+F131L、L148P+I69M+A156E+L175E、L148P+S70G+S113N+Y172R、L148P+S79T+A126G+S152D、L148P+I94A+F131P+V174M、L148P+I94L+Y138L+V174T、L148P+I94N+N130D+L206I、L148P+K96E+F131W+F166I、L148P+V98H+T119K+F166T、L148P+V98Q+Y138S+A170E、L148P+V98L+K135E+V174L、L148P+M107E+S152N+L175K、L148P+T108R+A126S+K168E、L148P+S109N+F131I+F154L、L148P+T119C+Y125H+K135E、L148P+F131A+K142R+V174S、L148P+S152G+F166V+I205V、L148P+P19K+K96P+V150P+A126S、L148P+P19M+M107N+F166P+V174T、L148P+Q41D+T108L+K144A+V153S、L148P+Q41G+T51Y+S113N+F166I、L148P+Q41N+T51F+A93S+F131A、L148P+Q41N+Y80A+S152G+L175E、L148P+Q41T+Y80A+V150E+Y172A、L148P+Q41T+I73A+S113N+L175...

【专利技术属性】
技术研发人员：洪浩，詹姆斯，
申请(专利权)人：天津凯莱英生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：