一种二硫化钼和金纳米笼修饰的电化学生物芯片及其应用制造技术

本发明专利技术公开了一种二硫化钼和金纳米笼修饰的电化学生物芯片及其应用，针对超级耐药菌基因

【技术实现步骤摘要】
一种二硫化钼和金纳米笼修饰的电化学生物芯片及其应用


[0001]本专利技术属于诊断领域，具体涉及二硫化钼和金纳米笼修饰的电化学生物芯片，还涉及该生物芯片的制备方法和应用
。

技术介绍

[0002]细菌对抗生素的压力选择是细菌获得耐药性的主要途径，抗生素的滥用是细菌产生耐药酶的直接原因
。
近年来，多重耐药菌
(Multidrug
‑
Resistant Organism
，
MDRO)
是医院感染重要的病原菌，其引起的复杂性
、
难治性细菌感染已经成为严重的公共卫生问题
。MDRO
是指对临床使用的三类或三类以上抗菌药物同时耐药的细菌
。
由于其耐药性已不再是仅仅针对数种抗生素，而是对绝大多数抗生素耐药
。
因此，
MDRO
常被称为“超级细菌”。
由于其超强的水解抗生素能力及世界范围内的广泛流行而备受关注
。
多重耐药菌的传播和流行，对院内感染的控制和临床抗感染治疗增加了难度
。
面对
MDRO
日益严峻的防控形式，世界卫生组织呼吁全球加强诊疗手段研发，避免其大规模流行
。
[0003]现有的超级耐药菌检测方法包括常规药敏检测
、LAMP
法
、PCR、
测序等，但上述方法均存在细菌培养分离时间长
、
检测效率低
、
特异性差/>、
检测通量低等缺点，由此，需要建立快速特异的超级耐药菌检测方法，才能为多重耐药菌的早诊早治提供简单有效
、
灵敏特异的解决方案
。
新近研究发现，产生新德里金属
β
‑
内酰胺酶
‑
1(New Delhi metallo
‑
β
‑
lactamase,NDM
‑
1)
耐药菌携带
blaNDM
‑1基因，是超广谱酶中最重要的耐药酶，该酶能够水解除氨曲南以外几乎所有的
β
‑
内酰胺类抗生素，导致其广泛耐药的主要原因
。
因此，产
NDM
‑1超级耐药菌的快速超敏检测对该类细菌的有效防控具有重要意义
。

技术实现思路

[0004]有鉴于此，本专利技术的目的在于提供一种二硫化钼和金纳米笼修饰的电化学生物芯片及其应用，可实现对产
NDM
‑1超级耐药菌的快速超敏检测
。
[0005]为达到上述目的，本专利技术提供如下技术方案：
[0006]一种二硫化钼和金纳米笼修饰的电化学生物芯片的制备方法，具体步骤如下：
[0007](1)
先以玻璃为芯片基底，通过丝网印刷技术印制若干个独立电极，每个电极上方对应位置取高分子塑料件开孔作为生物反应器，得到芯片；
[0008](2)
设计特异性
PNA
探针以及相应的桥联
DNA
序列；
[0009](3)
然后在步骤
(1)
所得芯片表面滴加纳米二硫化钼水溶液从而静电吸附纳米二硫化钼，再向芯片表面滴加金纳米笼溶液，接着滴加
PNA
探针溶液，恒温孵育，封闭，静置，得到预修饰电化学生物芯片；
[0010](4)
最后在预修饰电化学生物芯片表面滴加
20
μ
L NDM
‑1质粒水溶液，恒温杂交，即得所述的电化学生物芯片
。
[0011]优选的，步骤
(1)
中，芯片基底呈2×8阵列，独立电极个数为
16
个
。
[0012]优选的，步骤
(1)
中，所得芯片进行清洗
、
活化，具体方法如下：将芯片放入玻璃培
养皿中，按体积比2：1加入丙酮和无水乙醇，使得芯片完全浸没，
40KHz
超声清洗
40
分钟；用超纯水冲洗干净，再放入
0.1
～
0.5mM
稀硫酸中浸泡
30min
，超纯水冲洗；将芯片置于电化学生物检测仪，每个芯片加
0.1M PBS(0.1M
，
pH
＝
7.4)
，进行活化后，无水乙醇中超声
20min
，超纯水冲洗，氮气吹干备用
。
[0013]优选的，步骤
(3)
中，纳米二硫化钼水溶液的浓度为
1mg/mL
，金纳米笼水溶液的浓度为
0.05mg/mL
，其所含金纳米笼的粒径为
60nm
，
PNA
探针溶液的浓度为
1.5
μ
M。
[0014]优选的，步骤
(3)
中，恒温孵育的工艺条件为：
40℃
恒温孵育1小时
。
[0015]优选的，步骤
(3)
中，利用
1mmol/L
巯基己醇溶液进行封闭；静置时间为1小时；所得预修饰电化学生物芯片于
4℃
保存备用
。
[0016]优选的，步骤
(4)
中，恒温杂交的工艺条件为：
40℃
恒温杂交
20
分钟
。
[0017]一种二硫化钼和金纳米笼修饰的电化学生物芯片，是通过前述制备方法得到的
。
[0018]前述一种二硫化钼和金纳米笼修饰的电化学生物芯片在产
NDM
‑1超级耐药菌检测中的应用
。
[0019]本专利技术的有益效果在于：
[0020]针对超级耐药菌基因
NDM
‑1，本专利技术设计高特异性肽核酸
(Peptide Nucleic Acid
，
PNA)
探针，将
PNA
探针修饰于电化学传感器检测芯片表面，
PNA
探针可与检测液中的被检靶序列特异性结合，形成稳定的
PNA/DNA
复合体，采用新型纳米金材料进一步富集检测靶标
。
在此基础上，以双链特异性核酸酶
(duplex
‑
specific nuclease
，
DSN)
进行目标物循环，实现检测信号高效放大，实现对产
NDM
‑1超级耐药菌的直接超敏检测
。
附图说明
[0021]为了使本专利技术的目的
、
技术方案和有益效果更加清楚，本专利技术提供如下附图进行说明
。
[0022]图1为金纳米笼
(A)
以及金本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.
一种二硫化钼和金纳米笼修饰的电化学生物芯片的制备方法，其特征在于，具体步骤如下：
(1)
先以玻璃为芯片基底，通过丝网印刷技术印制若干个独立电极，每个电极上方对应位置取高分子塑料件开孔作为生物反应器，得到芯片；
(2)
设计特异性
PNA
探针以及相应的桥联
DNA
序列；
(3)
然后在步骤
(1)
所得芯片表面滴加纳米二硫化钼水溶液从而静电吸附纳米二硫化钼，再向芯片表面滴加金纳米笼溶液，接着滴加
PNA
探针溶液，恒温孵育，封闭，静置，得到预修饰电化学生物芯片；
(4)
最后在预修饰电化学生物芯片表面滴加
20
μ
L NDM
‑1质粒水溶液，恒温杂交，即得所述的电化学生物芯片
。2.
根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤
(1)
中，芯片基底呈2×8阵列，独立电极个数为
16
个
。3.
根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤
(1)
中，所得芯片进行清洗
、
活化，具体方法如下：将芯片放入玻璃培养皿中，按体积比2：1加入丙酮和无水乙醇，使得芯片完全浸没，
40KHz
超声清洗
40
分钟；用超纯水冲洗干净，再放入
0.1
～
0.5mM
稀硫酸中浸泡
30min
，超纯水冲洗；将芯片置于电化学...

【专利技术属性】
技术研发人员：王云霞，熊瑜，刘智勇，杨媚，
申请(专利权)人：中国人民解放军陆军军医大学第一附属医院，
类型：发明
国别省市：