含有硫代磷酸酯键的制造技术

本发明专利技术提供了一种含有硫代磷酸酯键的

【技术实现步骤摘要】
含有硫代磷酸酯键的RNA及其制备方法


[0001]本专利技术涉及
RNA
制备领域，具体而言，涉及一种含有硫代磷酸酯键的
RNA
及其制备方法
。

技术介绍

[0002]RNA
药物是近年来的新型药物，其按作用机制分为三类：一是以核酸为靶向，抑制或激活基因表达活性的小核酸类药物，包括反义寡核苷酸（
antisense oligonucleotide
，
ASO
）
、
小干扰
RNA
（
small interfering RNA
，
siRNA
）
、
微小
RNA
（
microRNA
，
miRNA
）
、
小激活
RNA
（
small activating RNA
，
saRNA
）等；二是以蛋白为靶向，调节蛋白质活性的
RNA
适配体（
RNA aptamer
）；三是编码治疗性蛋白或抗原的信使
RNA
（
messenger RNA
，
mRNA
）
。RNA
药物有很多优点，如靶向性强，设计简便
、
研发周期短，候选靶点丰富等
。
自美国
FDA
在
1998
年批准上市第一款
RNA
药物
fomivirsen
（已撤市）后，截至目前，市面上有几十种
RNA
药物，同时有更多的
RNA
药物正处在研发和临床研究阶段
。
[0003]稳定性化学修饰是核酸药物设计策略的关键之一
。
安全性与疗效是 RNA 靶向药物设计与开发所面临的主要挑战，也是早期药物研发失败的主要原因
。
寡核苷酸的磷酸二酯键的硫代修饰，即核苷酸间磷酸二酯键的
P
‑
OH
或
P=O
中的氧原子被硫原子取代，已经被广泛应用于
RNA
药物的开发
。RNA
药物磷酸二酯键的硫代修饰具有增加核酸酶抗性和促进与血浆蛋白结合的双重作用，能够延长药物的清除半衰期，增加药物的体内循环时间，改善药物的药代动力学
。
与此同时，硫代修饰会引入手性，使两种取向具有明显不同的药代动力学和药效学性质，影响药物的开发；硫代修饰也会降低寡核苷酸对靶标的亲和力
。
但现有技术中对于硫代寡核苷酸的合成主要是在固相合成过程中用硫代试剂进行化学反应制备，尚无利用酶催化等生物学方法制备含有硫代磷酸酯键的
RNA
的研究
。

技术实现思路

[0004]本专利技术的主要目的在于提供一种含有硫代磷酸酯键的
RNA
及其制备方法，以解决现有技术中的难以利用酶催化方法制备含有硫代磷酸酯键的
RNA
的问题
。
[0005]为了实现上述目的，根据本专利技术的第一个方面，提供了一种含有硫代磷酸酯键的
RNA
的制备方法，该制备方法包括：利用
RNA
连接酶催化底物的
3'
羟基与
5'
硫代磷酸连接，形成含有硫代磷酸酯键的
RNA
；
5'
硫代磷酸包括含有硫代修饰的
5'
磷酸，硫代修饰包括
5'
磷酸的
P
‑
OH
或
P=O
中的氧原子被硫原子取代，相应地变为
P
‑
SH
或
P=S
；
RNA
连接酶家族
1、2
或3中任意的一种或多种酶
。
[0006]进一步地，
RNA
连接酶包括
SEQ ID NO
：
1、SEQ ID NO
：
2、SEQ ID NO
：
3、SEQ ID NO
：
4、SEQ ID NO
：
5、SEQ ID NO
：
6、SEQ ID NO
：
7、SEQ ID NO
：
8、SEQ ID NO
：
9、SEQ ID NO
：
10、SEQ ID NO
：
11、SEQ ID NO
：
12、SEQ ID NO
：
13、SEQ ID NO
：
14、SEQ ID NO
：
15、SEQ ID NO
：
16、SEQ ID NO
：
17、SEQ ID NO
：
18、SEQ ID NO
：
19、SEQ ID NO
：
20、SEQ ID NO
：
21
或
SEQ ID NO
：
22
所示的
RNA
连接酶中的一种或多种；或与
SEQ ID NO
：
1~SEQ ID NO
：
22
中所示的任一种
RNA
连接酶具有
70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、99.5%
乃至
99.9%
以上同一性的酶，且具有催化
3'
羟基与
5'
硫代磷酸连接的活性的蛋白
。
[0007]进一步地，底物包括单链
RNA
或双链
RNA
，相应地，含有硫代磷酸酯键的
RNA
包括含有硫代磷酸酯键的单链
RNA
或含有硫代磷酸酯键的双链
RNA
；底物包括1个
、2
个或更多个
。
[0008]进一步地，当底物为1个，底物为单链
RNA
时，底物的
5'
端为
5'
硫代磷酸，底物的
3'
端为
3'
羟基，底物的
5'
端和底物的
3'
端在
RNA
连接酶的催化下连接
、
环化，获得环状的含有硫代磷酸酯键的单链
RNA。
[0009]进一步地，利用夹板指导单链
RNA
的环化，夹板与单链
RNA
的从
3'
端至
5'
端的至少3个碱基特异性本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.
一种含有硫代磷酸酯键的
RNA
的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括：利用
RNA
连接酶催化底物的
3'
羟基与
5'
硫代磷酸连接，形成所述含有硫代磷酸酯键的
RNA
；所述
5'
硫代磷酸包括含有硫代修饰的
5'
磷酸，所述硫代修饰包括所述
5'
磷酸的
P
‑
OH
或
P=O
中的氧原子被硫原子取代，相应地变为
P
‑
SH
或
P=S
；所述
RNA
连接酶包括
RNA
连接酶家族
1、2
或3中任意的一种或多种酶
。2.
根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述
RNA
连接酶包括：
SEQ ID NO
：
1、SEQ ID NO
：
2、SEQ ID NO
：
3、SEQ ID NO
：
4、SEQ ID NO
：
5、SEQ ID NO
：
6、SEQ ID NO
：
7、SEQ ID NO
：
8、SEQ ID NO
：
9、SEQ ID NO
：
10、SEQ ID NO
：
11、SEQ ID NO
：
12、SEQ ID NO
：
13、SEQ ID NO
：
14、SEQ ID NO
：
15、SEQ ID NO
：
16、SEQ ID NO
：
17、SEQ ID NO
：
18、SEQ ID NO
：
19、SEQ ID NO
：
20、SEQ ID NO
：
21
或
SEQ ID NO
：
22
所示的
RNA
连接酶中的一种或多种；或与
SEQ ID NO
：
1~SEQ ID NO
：
22
中所示的任一种
RNA
连接酶具有
70%
以上同一性的酶，且具有催化
3'
羟基与
5'
硫代磷酸连接的活性的蛋白
。3.
根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述底物包括单链
RNA
或双链
RNA
，相应地，所述含有硫代磷酸酯键的
RNA
包括含有硫代磷酸酯键的单链
RNA
或含有硫代磷酸酯键的双链
RNA
；所述底物包括1个
、2
个或更多个
。4.
根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，当所述底物为1个，所述底物为所述单链
RNA
时，所述底物的
5'
端为所述
5'
硫代磷酸，所述底物的
3'
端为所述
3'
羟基，所述底物的
5'
端和所述底物的
3'
端在所述
RNA
连接酶的催化下连接
、
环化，获得环状的所述含有硫代磷酸酯键的单链
RNA。5.
根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，利用夹板指导所述单链
RNA
的环化，所述夹板与所述单链
RNA
的从
3'
端至
5'
端的至少3个碱基特异性结合，所述夹板与所述单链
RNA
的从
5'
端至
3'
端的至少3个碱基特异性结合，所述夹板上的与所述单链
RNA
的
3'
端特异性结合的碱基，和与所述单链
RNA
的
5'
端特异性结合的碱基相邻
。6.
根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，当所述底物为2个，所述底物为所述单链
RNA
时，所述底物包括第一底物和第二底物，所述第一底物的
3'
端为所述
3'
羟基，所述第二底物的
5'
端为所述
5'
硫代磷酸，所述第一底物的
3'
端和所述第二底物的
5'
端在所述
RNA
连接酶的催化下连接，获得线性的所述含有硫代磷酸酯键的单链
RNA。7.
根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于，所述第二底物的
3'
端为
3'
保护基，且所述第一底物的
5'
端为
5'
保护基
。8.
根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，当所述底物为2个，所述底物为所述双链
RNA
时，所述底物包括正义链和反义链，所述底物包括第一底物和第二底物；所述第一底物的正义链的
3'
端为所述
3'
羟基，所述第一底物的反义链的
5'
端为
5'
磷酸；所述第二底物的正义链的
5'
端为所述
5'
磷酸，所述第二底物的反义链的
3'
端为所述
3'
羟基；所述第一底物的反义链和所述第二底物的正义链的
5'
磷酸中至少有一个为所述
5'
硫
代磷酸；所述第一底物的正义链的
3'
端和所述第二底物的正义链的
5'
端，在所述
RNA

【专利技术属性】
技术研发人员：洪浩，詹姆斯，
申请(专利权)人：天津凯莱英制药有限公司，
类型：发明
国别省市：