一种降解杀虫剂的肠球菌菌株及其用途制造技术

本发明专利技术公开了一种降解杀虫剂的酪黄肠球菌菌株及其用途，所述酪黄肠球菌菌株的保藏名称为：EMBL

【技术实现步骤摘要】
一种降解杀虫剂的肠球菌菌株及其用途


[0001]本专利技术涉及一种细菌菌株，尤其涉及酪黄肠球菌菌株及其用途。

技术介绍

[0002]草地贪夜蛾是联合国粮农组织发出全球预警的极具破坏性重要害虫，自2018年12月首次从缅甸入侵我国南部以来，已迅速扩散蔓延我国多个省份，并有继续北扩趋势，对多种重要农作物的生产构成严重威胁。为保证作物的安全生产，杀虫剂的使用尤为重要，以氯虫苯甲酰胺为代表的双酰胺类杀虫剂是目前防治草地贪夜蛾的首要推荐药剂，在防控草地贪夜蛾的过程中发挥了关键的作用。由于农药不合理不科学的使用引发的环境问题和抗药性问题日益严重，根据近年来抗性监测数据显示，目前，在美国波多黎各部分地区已监测到草地贪夜蛾对氯虫苯甲酰胺的高水平抗性，而国内草地贪夜蛾田间种群虽然对氯虫苯甲酰胺仍处于低抗性水平，但有持续上升趋势，形势不容乐观。草地贪夜蛾对新型杀虫剂抗性的发展严重掣肘草地贪夜蛾的高效防治，对农作物的保质保量生产造成极大威胁，为成功防治害虫所增加的农药量大量渗入环境，致使环境污染问题不可忽视。因此，挖掘并开发可用于“克抗”靶点、农药污染环境修复的杀虫剂降解菌尤为重要。
[0003]近年来昆虫肠道被认为是包含各种营养合成和异源物质代谢活性基因的天然反应器，其容纳多功能、多样化的微生物是自然界中重要的资源库。害虫产生抗性的重要原因是其对杀虫剂的解毒代谢能力增强，越来越多的证据证实共生菌是害虫杀虫剂解毒代谢的重要参与者。在点蜂缘蝽、桔小实蝇等害虫中，一些共生菌的定殖可直接降解杀虫剂增强宿主的抗药性，此外，目前已有昆虫肠道来源的杀虫剂降解菌亦被大量发现，这些细菌分离株可作为环境修复和异源物质降解转化的有效开发。然而，目前仍未有研究报道肠球菌菌株参与杀虫剂的降解和转化。我们从草地贪夜蛾幼虫肠道微生物中分离获得一株肠球菌菌株Enterococcus casseliflavus EMBL
‑
3，并证实了该菌株降解杀虫剂氯虫苯甲酰胺的能力。E.casseliflavus几乎存在于所有的鳞翅目害虫中，因此它在害虫防治技术和环境修复治理领域内具有很大的应用前景。

技术实现思路

[0004]本专利技术的目的在于针对现有技术的不足，提供一种肠球菌菌株及其用途，可以为解决害虫抗药性靶点选择和环境中的杀虫剂氯虫苯甲酰胺污染提供新策略和新方法。
[0005]本专利技术的肠球菌菌株为酪黄肠球菌菌株(Enterococcus casseliflavus)，保藏信息：保藏名称为EMBL
‑
3，保藏单位：中国典型培养物保藏中心，保藏日期：2023年07月17日，保藏号：CCTCC M 20231305。
[0006]本研究中的菌株来源新颖，是从外来入侵害虫草地贪夜蛾幼虫的肠道中分离的，是从害虫肠道分离出的有益菌株，并且通过研究验证该菌株可用于氯虫苯甲酰胺的降解，是首株被发现能降解氯虫苯甲酰胺的肠球菌菌属成员。
[0007]所述菌株为细菌
‑
酪黄肠球菌EMBL
‑
3，酪黄肠球菌是鳞翅目害虫肠道种一种普遍
的共生菌，并且是家蚕体内非常重要的色氨酸生产者。以上研究说明该菌是大多数鳞翅目害虫的有益共生菌，然而尚未见关于该菌对杀虫剂降解转化能力的报道。
[0008]此外，本专利技术还提供一种杀虫剂污染修复剂，即含有所述菌株或其培养液或干粉制剂，利用所述菌株或其培养物能够用于杀虫剂的降解。本专利技术还可以基于用于鉴定微生物降解杀虫剂活性蛋白的方法，能够初步筛选鉴定出降解氯虫苯甲酰胺的潜在活性蛋白质，有利于害虫抗药性靶点选择的研究。
[0009]本专利技术的有益效果是：
[0010]本专利技术发现所述菌株可在短时间的液体培养条件下(3天)即可对氯虫苯甲酰胺有明显的降解，可以使氯虫苯甲酰胺的浓度减少25％。通过胞内和胞外蛋白的氯虫苯甲酰胺预暴露的蛋白组结果可筛选鉴定降解氯虫苯甲酰胺的潜在活性蛋白质，并进一步推测降解机制，氯虫苯甲酰胺分子化学键断裂，可能涉及酰胺键断裂和脱卤反应。
[0011]具体液体培养条件为：试验分为四组：
①
最小无机盐液体培养基(MSM)添加10mg/L的氯虫苯甲酰胺作为对照组；
②
最小无机盐液体培养基(MSM)添加10mg/L的氯虫苯甲酰胺及EMBL
‑
3菌株培养物；
③
最小无机盐液体培养基(MSM)添加100mg/L的EMBL
‑
3的细胞内蛋白质提取物；
④
最小无机盐液体培养基(MSM)添加100mg/L的EMBL
‑
3的细胞外蛋白质提取物。所有处理均置于30℃，控温摇床中150rpm/min培养3天，期间在设置的时间点(1d，2d和3d)进行检测。
附图说明
[0012]图1EMBL
‑
3菌株在LB平板上的生长状态；
[0013]图2EMBL
‑
3菌株与氯虫苯甲酰胺培养3天期间的菌株生长曲线；
[0014]图3EMBL
‑
3菌株对氯虫苯甲酰胺的降解效率；
[0015]图4EMBL
‑
3菌株胞内和胞外蛋白质对氯虫苯甲酰胺的降解效率；
[0016]图5EMBL
‑
3菌株胞内和胞外蛋白对氯虫苯甲酰胺的响应；
[0017]图6EMBL
‑
3菌株对氯虫苯甲酰胺的潜在降解蛋白；
[0018]图7EMBL
‑
3菌株对氯虫苯甲酰胺降解产物的质谱图；
[0019]图8EMBL
‑
3菌株对氯虫苯甲酰胺的潜在降解过程。
具体实施方式
[0020]下面结合附图和具体实施例对本专利技术做进一步的说明。
[0021]实施例1、酪黄肠球菌EMBL
‑
3(Enterococcus casseliflavus EMBL
‑
3)的分离培养与鉴定：
[0022]将喂食氯虫苯甲酰胺亚致死浓度(LC
50
)后2天后存活的草地贪夜蛾幼虫在无菌条件下解剖，获得其肠道。15个肠道合并为一组，加入生理盐水，研磨震荡，获得肠道内容物混合溶液，将肠道内容物混合溶液梯度稀释10
‑1至10
‑7倍涂布于含氯虫苯甲酰胺的固体无机盐培养基平板中，放置于30℃培养，待长出一定大小的单菌落后，通过挑取单菌落在富营养的LB液体培养基扩大培养，进一步划线挑取单菌落纯化，待平板上长出可见菌落后，再次进行传代培养，直到获得纯菌株。然后将纯菌株再次接种到含氯虫苯甲酰胺的液体无机盐培养基中进行培养，如菌株能以氯虫苯甲酰胺为唯一能源物质生长，即为氯虫苯甲酰胺降解
菌株，记为EMBL
‑
3菌株。
[0023]实施例2、菌株EMBL
‑
3的鉴定
[0024]获得EMBL
‑
3菌株后，对其进行菌株鉴定，判断其物种分类。因此采用本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.酪黄肠球菌(Enterococcus casseliflavus)菌株，其特征在于，保藏名称为：EMBL
‑
3，保藏单位：中国典型培养物保藏中心，保藏日期：2023年07月17日，保藏号：CCTCC M 20231305。2.酪黄肠球菌菌株的用途，其特征在于，用于降解杀虫剂氯虫苯甲酰胺。3.一种用于降解氯虫苯甲酰胺的方法，其特征在于，该方法包括培养如权利要求1所述的菌株，将待降解氯虫苯甲酰胺或含待降解氯虫苯甲酰胺的物质与菌株培养液接触。4.根据权利要...

【专利技术属性】
技术研发人员：鞠峰，张云骅，
申请(专利权)人：西湖大学，
类型：发明
国别省市：