一种携带自杀基因的支持细胞永生化细胞系的构建方法和应用技术

本发明专利技术提供了一种携带自杀基因的支持细胞永生化细胞系的构建方法和应用，从新生1

【技术实现步骤摘要】
一种携带自杀基因的支持细胞永生化细胞系的构建方法和应用


[0001]本专利技术属于细胞
，尤其是涉及一种携带自杀基因的支持细胞永生化细胞系的构建方法和应用。

技术介绍

[0002]支持细胞是位于生精小管的体细胞，具有很大的细胞体积，从基底膜贯穿生精上皮的全层延伸至生精小管的官腔，包绕各级生精细胞，精原细胞发育为成熟精子的整个过程均依附于支持细胞的胞体进行。支持细胞是该微环境重要的组成部分，在调控精子发生的过程中发挥着重要的作用。通常支持细胞被称为生殖细胞的营养细胞，充分表明了其对男性生殖细胞发育和成熟具有不可或缺的作用。支持细胞的相关研究对于脊髓及脑损伤具有重要的意义，主要由以下三个方面的原因。支持细胞是被认为是免疫豁免的细胞，通过表达Fas配体(FasL)和转化生长因子B1(TGFB1)等免疫调节因子来抵御免疫系统的攻击。此外，支持细胞的这种免疫调节能力不局限于睾丸组织，因为有研究表明支持细胞可以在异位组织和器官中存活。这一珍贵特性使得支持细胞在损伤区内不会引起机体的免疫排斥，能够长期存活。此外，支持细胞能够调节损伤区炎性环境来提升组织再生的效果。因此目前研究认为移植支持细胞能够对多种炎性相关疾病起到治疗作用，然而支持细胞获取困难，对其进行永生化，可控化的处理是一个很好的策略。永生化细胞是指脱离了正常衰老死亡过程并获得持续分裂能力的原代细胞，具有易于培养和传代、均一性等优点。细胞永生化改造可通过将端粒酶hTERT基因，SV40基因、腺病毒EIA等导入原代细胞早期生长阶段而获得。其中hTERT基因应用最为广泛。然而永生化细胞在体内应用存在细胞生长繁殖不可控，具有潜在成瘤的风险。

技术实现思路

[0003]针对以上技术问题，本专利技术第一方面提供了一种携带自杀基因的支持细胞永生化细胞系的构建方法，包括以下步骤：
[0004]消化步骤将动物曲精小管取出后用生理盐水冲洗，用眼科剪将其剪碎并与复合消化酶溶液混合，在35℃条件下消化15分钟，得曲精小管消化混合物；所述动物包括但不限于大鼠、小鼠、猴、牛、羊、猪、狗或兔；
[0005]细胞悬液制备步骤用50
‑
70μm的过滤网对曲精小管消化混合物进行过滤得过滤液，即为细胞悬液；
[0006]第一次离心步骤将细胞悬液进行第一次离心，离心速度为300rpm/min，离心时间为5分钟，弃掉管底沉渣，获得第一次离心上清液；
[0007]第二次离心步骤将第一次离心上清液进行第二次离心，离心速度为1200rpm/min
‑
2000rpm/min，离心时间为5分钟，收集管底离心细胞；
[0008]转染前细胞培养步骤将离心获得的细胞接种于完全培养基中，待贴壁12小时后全
量换液，将悬浮及半贴壁的精原干细胞清除；待细胞汇合达到70％
‑
80％时，以消化酶消化1
‑
3分钟，以1:3传代；待细胞生长至第3代时用于转染；
[0009]第一次转染步骤以支持细胞为宿主细胞，用pGMLV
‑
hTERT
‑
PURO慢病毒载体对支持细胞进行转染，转染方式为电转；
[0010]第一次转染后细胞培养步骤将转染后的支持细胞传代培养3
‑
10代后，筛选阳性克隆，经过生物学性状鉴定，得到永生化动物支持细胞系；
[0011]第二次转染步骤再以永生化支持细胞系为宿主细胞，用pGMLV
‑
CD
‑
PURO慢病毒载体对其进行转染，转染方式为电转；
[0012]第二次转染后细胞培养步骤将转染后的支持细胞传代培养3
‑
10代后，筛选阳性克隆，经过生物学性状鉴定，得到一种携带自杀基因的支持细胞永生化细胞系。
[0013]进一步的一种携带自杀基因的支持细胞永生化细胞系的构建方法，其中，
[0014]消化步骤中，所述动物为出生1
‑
10天的雄性；复合消化酶溶液包括0.2％四型胶原酶、0.1％透明质酸酶、0.1％胰酶、15U/ml DNA酶组成。
[0015]进一步的一种携带自杀基因的支持细胞永生化细胞系的构建方法，其中，
[0016]转染前细胞培养步骤中，所述的完全培养基包括添加10
‑
20％胎牛血清得DMEM/F12培养基。
[0017]进一步的一种携带自杀基因的支持细胞永生化细胞系的构建方法，其中，
[0018]转染前细胞培养步骤中，所述消化酶包括0.25％胰酶；原代支持细胞表面标记物为肾母细胞瘤蛋白(WT
‑
1)和双性与mab
‑
3相关转录因子1(DMRT1)。
[0019]进一步的一种携带自杀基因的支持细胞永生化细胞系的构建方法，其中，
[0020]第一次转染步骤中，所述pGMLV
‑
hTERT
‑
PURO慢病毒载体所包含的hTERT基因的序列如SEQ ID NO.1所示。
[0021]进一步的一种携带自杀基因的支持细胞永生化细胞系的构建方法，其中，
[0022]第二次转染步骤中，所述pGMLV
‑
CD
‑
PURO慢病毒载体所包含的CD基因的序列如SEQ ID NO.2所示。
[0023]进一步的一种携带自杀基因的支持细胞永生化细胞系的构建方法，其中，第一次转染步骤和第二次转染步骤中，用于电转的细胞密度为0.1
‑3×
107个细胞/mL。
[0024]进一步的一种携带自杀基因的支持细胞永生化细胞系的构建方法，其中，第一次转染步骤和第二次转染步骤中，电转染条件如下：脉冲电压150
‑
250V、驱动电压10
‑
30V、脉冲时间1
‑
30ms、循环次数为1
‑
30。
[0025]进一步的一种携带自杀基因的支持细胞永生化细胞系的构建方法，其中，
[0026]第一次转染步骤和第二次转染步骤中，所述的慢病毒载体在电转液中的浓度为1
‑
40μg/mL。
[0027]进一步的一种携带自杀基因的支持细胞永生化细胞系的构建方法，其，第一次转染步骤和第二次转染步骤中，所述的筛选阳性克隆所用的puromycin浓度为2
‑
10μg/ml。
[0028]本专利技术的第二方面还提供了一种采用前述任意一项所述的构建方法得到的携带自杀基因的支持细胞永生化细胞系。
[0029]本专利技术的第三方面提供了一种永生化携带自杀基因的支持细胞在如下A～C中任一项的应用：
[0030]A确定细胞增殖及衰老机制；
[0031]B评价其在药物筛选中的应用；
[0032]C评价其在炎性相关疾病中的治疗作用。
[0033]本专利技术的有益效果在于，提供了一种携带自杀基因的支持细胞永生化细胞系的构建方法和应用，从新生1
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【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种携带自杀基因的支持细胞永生化细胞系的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：消化步骤将动物曲精小管取出后用生理盐水冲洗，用眼科剪将其剪碎并与复合消化酶溶液混合，在35℃条件下消化15分钟，得曲精小管消化混合物；所述动物包括但不限于大鼠、小鼠、猴、牛、羊、猪、狗或兔；细胞悬液制备步骤用50
‑
70μm的过滤网对曲精小管消化混合物进行过滤得过滤液，即为细胞悬液；第一次离心步骤将细胞悬液进行第一次离心，离心速度为300rpm/min，离心时间为5分钟，弃掉管底沉渣，获得第一次离心上清液；第二次离心步骤将第一次离心上清液进行第二次离心，离心速度为1200rpm/min
‑
2000rpm/min，离心时间为5分钟，收集管底离心细胞；转染前细胞培养步骤将离心获得的细胞接种于完全培养基中，待贴壁12小时后全量换液，将悬浮及半贴壁的精原干细胞清除；待细胞汇合达到70％
‑
80％时，以消化酶消化1
‑
3分钟，以1:3传代；待细胞生长至第3代时用于转染；第一次转染步骤以支持细胞为宿主细胞，用pGMLV
‑
hTERT
‑
PURO慢病毒载体对支持细胞进行转染，转染方式为电转；第一次转染后细胞培养步骤将转染后的支持细胞传代培养3
‑
10代后，筛选阳性克隆，经过生物学性状鉴定，得到永生化支持细胞系；第二次转染步骤再以永生化支持细胞系为宿主细胞，用pGMLV
‑
CD
‑
PURO慢病毒载体对其进行转染，转染方式为电转；第二次转染后细胞培养步骤将转染后的支持细胞传代培养3
‑
10代后，筛选阳性克隆，经过生物学性状鉴定，得到一种携带自杀基因的支持细胞永生化细胞系。2.根据权利要求1所述的一种携带自杀基因的支持细胞永生化细胞系的构建方法，其特征在于，消化步骤中，所述动物为出生1
‑
10天的雄性；复合消化酶溶液包括0.2％四型胶原酶、0.1％透明质酸酶、0.1％胰酶、15U/ml DNA酶组成。3.根据权利要求1所述的一种携带自杀基因的支持细胞永生化细胞系的构建方法，其特征在于，转染前细胞培养步骤中，所述的完全培养基包括添加10
‑
20％胎牛血清得DMEM/F12培养基。4....

【专利技术属性】
技术研发人员：朱雷，程世翔，曹毓琳，陈凯，李霞云，张学伟，
申请(专利权)人：天津经济技术开发区唐颐细胞智造与神经创伤修复研究院，
类型：发明
国别省市：