一种抗A型肉毒毒素的抗体HUXA148.25及其应用制造技术

本发明专利技术涉及生物医学技术领域，具体公开了一种抗A型肉毒毒素的抗体HUXA148.25及其应用，包括轻链可变区和重链可变区，所述轻链可变区包括氨基酸序列分别如SEQ ID No.1

【技术实现步骤摘要】
一种抗A型肉毒毒素的抗体HUXA148.25及其应用


[0001]本专利技术涉及生物医学
，具体涉及一种抗A型肉毒毒素的抗体HUXA148.25及其应用。

技术介绍

[0002]肉毒梭菌(Clostridium botulinum)是厌氧的革兰氏阳性的芽孢菌，广泛存在于土壤中，在灭菌不良的密封性罐装食品中能够生长。肉毒梭菌是比较老的一种分类，能够产生毒素并导致肌肉软瘫的细菌被称为肉毒类细菌。肉毒类细菌根据其基因型和表型可以分为四组，第一、二组细菌可产生导致人类中毒的神经毒素，即肉毒毒素。第三组产生的神经外毒素人类虽然也易感，但是多见于动物中毒，人类中毒鲜有报道。第四类可产生肉毒毒素样蛋白，但是并未导致人或动物的中毒，故此类细菌改称为阿根廷梭菌(Clostridium argentinense)。根据对人类致病性分类，第一组主要产生A型、B型或F型毒素，第二组主要产生B型、E型或F型毒素。第一、二组肉毒梭菌各菌株间差异明显，第一组梭菌多见于温带地区，芽孢具有较高的热抵抗能力，常导致罐装食品以及家庭自制植物性食品(我国主要为豆制品，豆腐乳、豆瓣酱等发酵腌制类食品)以及家庭储存的肉类(如腊肉)等食物的污染。第二组多见于北半球大洋水产品中，特别是E型毒素最为典型，菌株芽孢对热抵抗力差，常导致冷藏类食物中毒。
[0003]肉毒毒素是典型的A
‑
B型细菌神经性外毒素。其前体蛋白为分子量150KD的无活性单链蛋白，由肉毒梭菌分泌时或者细菌培养液中被内切酶剪切、并重新组合为双链分子而活化。由链间二硫键链接100KD重链和50KD轻链，折叠为具有3个亚单位的功能性肉毒毒素。重链羧基端为靶细胞表面受体结合片段(receptor binding domain，RBD)，介导毒素识别并结合到哺乳动物外周α运动神经元神经肌肉接头的突触前膜，重链氨基端则介导毒素的跨膜转运，可将轻链或者全毒素转运至靶细胞内。轻链是锌离子依赖的蛋白内切酶，可以水解SNARE蛋白，抑制神经肌肉接头处突触前成份的乙酰胆碱(Ach)囊泡释放，继而造成神经肌肉接头处冲动传导障碍，引起肌肉软瘫。肉毒毒素患者死亡多是由于呼吸肌麻痹导致的。
[0004]肉毒毒素(botulinum neurotoxins，BoNTs)由肉毒梭菌产生，是典型的A
‑
B型神经外毒素，可以抑制神经肌肉接头处突触部位乙酰胆碱递质囊泡的释放，通过阻断神经肌肉接头处冲动传导造成的肌肉麻痹而发挥毒理作用。BoNTs是目前已知毒性最强的毒素，小于1微克即可以杀死一个成年人，至今已发现有7种血清型(A、B、C、D、E、F和G型)，其中引起人类中毒的主要是A、B、E和F型。BoNTs的制备、运输及释放相对其他毒素更为容易，因此美国疾病控制中心将其列为A类级别的生物威胁，其中以A型军事意义最大。BoNTs毒性大，性质稳定，制备工艺相对简单，易被恐怖分子获得，并且能够以气溶胶形式散布，容易污染食物和水源，是联合国《禁止生物武器公约》核查的重要生物战剂。在海湾战争期间，就曾在伊拉克方面查出疑似肉毒武器。更为重要的是，平时肉毒杆菌也可以污染肉类和罐头、奶粉等食品而引起食用者中毒，例如2013年新西兰恒天然公司加工厂因管线遭到肉毒杆菌污染，在全球7个国家内紧急召回1000吨乳清蛋白制品。2003年陕西省岐山县发生肉毒中毒事件，当
时全国范围内没有可用于救治的抗毒素，最终从德国获得抗毒素制剂空运到国内救治患者。目前美容注射肉毒毒素也日益普遍，不规范的操作同样具有潜在的肉毒毒素中毒危险。
[0005]抗肉毒人源化抗体可以替代传统的马血清，减少异种蛋白反应，最重要的优势在于发生紧急情况时，基因工程抗体可以迅速扩大产量，快速部署，是应对恐怖袭击和突发事件的一种有效遏制手段。另外，马抗血清的制备开支巨大，从抗原规模制备到马场管理等各个环节都不易操作。
[0006]单克隆抗体技术的出现是免疫学领域的重大突破，单抗制剂的广泛应用对生命科学研究和临床医疗实践都具有非同寻常的重要意义。利用靶向待检测抗原分子的特异性单克隆抗体，可以开发出定量检测相应抗原成分的高灵敏度试剂盒，而能检测到低剂量肉毒毒素的高灵敏度的方法对反生物武器战争和反恐怖袭击具有重要的军事用途，对于日常食物中毒的快速检测鉴定同样具有重要意义。与此同时，救治肉毒毒素中毒的最有效方法是尽早注射抗毒素抗体。利用单克隆抗体制备技术，开发并筛选出高亲和力高特异性的中和活性抗体，可以有效阻断肉毒毒素的致病毒理作用，挽救肉毒毒素中毒患者的生命。

技术实现思路

[0007]为制备新型抗肉毒毒素的单克隆抗体，本专利技术提供了一种抗A型肉毒毒素的抗体HUXA148.25及其应用，本专利技术提供的抗体HUXA148.25能够与A型肉毒毒素特异性结合，具有高度的中和活性，同时通过基因工程完成人源化改造，有效避免使用异种抗血清或异种抗体引起的免疫反应，为肉毒毒素中毒的诊疗提供更安全的有效手段。
[0008]本专利技术提供了一种抗A型肉毒毒素的抗体HUXA148.25，包括轻链可变区和重链可变区；
[0009]所述轻链可变区包括氨基酸序列分别如SEQ ID No.1
‑
SEQ ID NO.3所示的LCDR1、LCDR2和LCDR3；
[0010]所述重链可变区包括氨基酸序列分别如SEQ ID NO.4
‑
SEQ ID NO.6所示的HCDR1、HCDR2和HCDR3。
[0011]进一步地，编码所述轻链可变区LCDR1、LCDR2和LCDR3的核苷酸序列分别如SEQ ID NO.7
‑
SEQ ID NO.9所示。
[0012]进一步地，编码所述重链可变区HCDR1、HCDR2和HCDR3的核苷酸序列分别如SEQ ID NO.10
‑
SEQ ID NO.12所示。
[0013]本专利技术还提供了一种所述的抗A型肉毒毒素的抗体HUXA148.25的制备方法，包括如下步骤：
[0014]S1，重组表达的A型肉毒毒素重链蛋白免疫BALB/c小鼠、间接ELISA筛选血清抗体效价在1∶64 000以上的小鼠、取脾细胞与Sp2/0细胞完成细胞融合；
[0015]S2，经HAT选择性培养和有限稀释法的4次克隆化筛选，获得稳定分泌抗体的杂交瘤细胞株；
[0016]S3，BALB/c小鼠腹腔注射液体石蜡诱发腹腔炎症，7d后腹腔注射杂交瘤细胞；
[0017]S4，10d～14d后收集腹水，离心去除细胞碎片和液体石蜡后，依次用硫酸铵沉淀法和蛋白A/G法纯化获得抗A型肉毒毒素重链蛋白的单克隆抗体HUXA148.25。
[0018]进一步地，S1中，所述重组表达的A型肉毒毒素重链蛋白免疫小鼠剂量为：50μg/
次/只。
[0019]本专利技术还提供了一种检测产品，所述检测产品包含权利要求1所述的抗A型肉毒毒素的抗体HUXA148.25。
[0020]进一步地，所述检测产品为试剂盒。
[0021]本专利技术本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种抗A型肉毒毒素的抗体HUXA148.25，其特征在于，包括轻链可变区和重链可变区；所述轻链可变区包括氨基酸序列分别如SEQ ID NO.1
‑
SEQ ID NO.3所示的LCDR1、LCDR2和LCDR3；所述重链可变区包括氨基酸序列分别如SEQ ID NO.4
‑
SEQ ID NO.6所示的HCDR1、HCDR2和HCDR3。2.根据权利要求1所述的抗A型肉毒毒素的抗体HUXA148.25，其特征在于，编码所述轻链可变区LCDR1、LCDR2和LCDR3的核苷酸序列分别如SEQ ID NO.7
‑
SEQ ID NO.9所示。3.根据权利要求1所述的抗A型肉毒毒素的抗体HUXA148.25，其特征在于，编码所述重链可变区HCDR1、HCDR2和HCDR3的核苷酸序列分别如SEQ ID NO.10
‑
SEQ ID NO.12所示。4.一种权利要求1
‑
3任一项所述的抗A型肉毒毒素的抗体HUXA148.25的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：S1，重组表达的A型肉毒毒素重链蛋白免疫BALB/c小鼠、间接ELISA...

【专利技术属性】
技术研发人员：张圆，张赟，庄然，王玉玲，金伯泉，
申请(专利权)人：中国人民解放军空军军医大学，
类型：发明
国别省市：