一种利用乙酰辅酶A打破羽衣甘蓝自交不亲和性的方法技术

本发明专利技术涉及一种打破羽衣甘蓝自交不亲和性的试剂乙酰辅酶A，还涉及上述试剂在打破羽衣甘蓝自交不亲和性中的应用及所述试剂打破自交不亲和反应的有效浓度。本发明专利技术首次发现外源施加乙酰辅酶A能够有效地打破羽衣甘蓝自交不亲和反应，克服由自交不亲和性所引起的生殖隔离，促进亲和授粉，为提高采种率及新品种选育提供了有效手段。育提供了有效手段。

【技术实现步骤摘要】
一种利用乙酰辅酶A打破羽衣甘蓝自交不亲和性的方法


[0001]本专利技术属于十字花科芸薹属植物羽衣甘蓝育种攻关技术研究领域，具体涉及一种打破或削弱羽衣甘蓝自交不亲和反应的试剂乙酰辅酶A及其应用。

技术介绍

[0002]大多数开花植物的有性繁殖依赖于授粉后花粉和柱头之间的精确识别，花粉和柱头识别系统涉及复杂的分子信号通路和代谢物质。为促进理想的交配，避免不利后代产生，开花植物需要克服多重受精前生殖障碍，以完成优良后代繁育。自然界中，一些十字花科植物通过进化出自交不亲和反应，排斥自身花粉，接受异花花粉，以避免近亲繁殖，促进遗传多样性。当花粉与柱头接触时，会迅速诱发自交不亲和反应，抑制自身花粉，允许异花花粉水合萌发及花粉管生长。柱头受体与花粉配体间相互作用能够触发多级信号级联反应，为花粉的水合及萌发提供必要资源，如一些关键调控基因、蛋白、水分及其它代谢产物。
[0003]脂肪酸是为植物生命活动提供能量的最重要的营养物质和代谢产物之一。乙酰辅酶A作为脂肪酸生物合成前体，可以在乙酰辅酶A羧化酶的催化下转化为丙二酰辅酶A，此反应被称为脂肪酸从头合成的限速步骤，进一步在相关脂肪酸合成酶的催化下，经过一系列聚合反应生成相关脂肪酸。
[0004]打破植物自交不亲和反应，提高采种效率，成为植物生殖发育领域亟待解决的技术难题。目前，对于打破十字花科植物自交不亲和反应的物质开发有限，专利技术能够有效打破十字花科植物自交不亲和反应的物质，对于加速十字花科植物育种进程，开发新种质具有重要的应用价值。

技术实现思路

>[0005]针对自然界中十字花科芸苔属植物存在较多的自交不亲和反应现象，专利技术一种脂肪酸合成前体物质乙酰辅酶A，能够有效打破或削弱羽衣甘蓝自交不亲和反应，促进花粉黏附、水合、萌发和花粉管生长。
[0006]本专利技术提供了一种能够打破羽衣甘蓝自交不亲和反应，促进亲和授粉的试剂乙酰辅酶A。
[0007]本专利技术还提供了上述试剂打破羽衣甘蓝自交不亲和反应的所用试剂浓度。
[0008]本专利技术还提供了上述试剂打破羽衣甘蓝自交不亲和反应的应用方法，步骤如下：
[0009]步骤1：从所述羽衣甘蓝植株上采集未开放花蕾的成熟期柱头。
[0010]步骤2：将成熟期柱头插入到含有上述试剂的花柱孵育培养基中进行孵育。
[0011]步骤3：柱头在含上述试剂培养基中孵育一定时间后，进行自花授粉和异花授粉，继续培养一定时间。
[0012]步骤4：授粉一定时间后，将柱头放在卡诺氏固定液中固定。
[0013]步骤5：将固定后的柱头进行氢氧化钠溶液软化，再进行苯胺蓝溶液染色。
[0014]步骤6：对染色后的柱头进行制片，通过显微镜(OLYMPUSBX43F,TOKYO,JAPAN)对授
粉情况进行观察。
[0015]本专利技术的有益效果：
[0016]乙酰辅酶A是本专利技术新发现的具有打破羽衣甘蓝自交不亲和反应的试剂，该试剂对于打破自交不亲和反应具有明显效果，能够有效的促进花粉黏附、水合、萌发及花粉管生长，为提高作物采种率及品种选育提供了理论依据与实践价值。
附图说明
[0017]图1乙酰辅酶A处理羽衣甘蓝柱头后对亲和授粉后花粉黏附及花粉管生长的影响。星号(*)表示存在显著差异(***p≤0.001)，ns表示不存在显著差异，(n＝10)表示所检测样本数为10个，误差棒为样本数平均值的标准误差，比例尺为50μm。
[0018]图2乙酰辅酶A处理羽衣甘蓝柱头后对自花授粉后花粉黏附及花粉管生长的影响。星号(*)表示存在显著差异(***p≤0.001)，ns表示不存在显著差异，(n＝10)表示所检测样本数为10个，误差棒为样本数平均值的标准误差，比例尺为50μm。
具体实施方式
[0019]以下结合附图对本专利技术的原理和特征进行描述，所举实例只用于解释本专利技术，并非用于限定本专利技术的范围。
[0020]1.植物材料
[0021]自交不亲和系(S
13
‑
b
S
13
‑
b
)和亲和系(S
45
S
45
)羽衣甘蓝种植在东北林业大学花卉生物工程研究所。实验当天采取S
13
‑
b
S
13
‑
b
植株未开放的成熟花蕾，将花蕾装入保鲜袋中保鲜，以备后续实验所用。当天采取S
13
‑
b
S
13
‑
b
和S
45
S
45
植株具有成熟花粉的开放花朵，将带有花梗的花朵插入到装有适量水的PCR管中，放到温度(22℃)、湿度(45％)光照培养箱中，以保持花粉活力用于后续授粉实验。
[0022]2.乙酰辅酶A工作液配制
[0023]用水作为溶剂，溶解一定量乙酰辅酶A药品，作为原液储存在
‑
20℃冰箱中备用。将溶解好的乙酰辅酶A原液加到花柱孵育培养基中，使其工作液浓度分别为1mM和5mM，以备孵育柱头。
[0024]所述花柱孵育培养基配制方法为：5mM氯化钙，5mM氯化钾，1mM硫酸镁，0.01％硼酸，10％蔗糖，PH＝7.5，121℃，20min灭菌，1％琼脂粉现用现加，通过100℃金属浴溶解。
[0025]3.柱头孵育实验
[0026]取1mL花柱孵育液体培养基加入到1.5mL离心管中，加0.01g琼脂粉，通过100℃金属浴溶解，待温度冷却到60
‑
70℃时，加入所述乙酰辅酶A原液试剂，使其终浓度为1mM和5mM(不含有乙酰辅酶A的花柱孵育培养基作为对照组，含有终浓度1mM和5mM乙酰辅酶A的花柱孵育培养基作为处理组)，充分涡旋后，将花柱孵育培养基分装到1.5mL离心管盖子上，冷却凝固后用于孵育柱头。将采集的S
13
‑
b
S
13
‑
b
植株的花蕾进行人工去雄，利用手术刀将成熟柱头下方2
‑
3毫米的花柱切断，将柱头下方的花柱插入到花柱孵育培养基中，放到温度(22℃)、湿度(45％)的光照培养箱中进行孵育3h。
[0027]4.授粉实验
[0028]取S
13
‑
b
S
13
‑
b
植株成熟花粉对孵育过的S
13
‑
b
S
13
‑
b
柱头进行自花授粉，取S
45
S
45
植株成
熟花粉对孵育过的S
13
‑
b
S
13
‑
b
柱头进行异花授粉，自花及异花授粉后放到温度(22℃)、湿度(45％)的光照培养箱中进行培养6h。
[0029]5.自花及异花授粉后花粉黏附及花粉管生长情本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种打破羽衣甘蓝自交不亲和性的试剂乙酰辅酶A。2.权利要求1所述的试剂在打破羽衣甘蓝自交不亲和性中的应用。3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于：利用含有不同浓度乙酰辅酶A的花柱孵育培养基孵育自交不亲和系羽衣甘蓝成熟柱头，并进行自花及异花授粉。4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于：所述的花柱孵育培养基中所含乙酰辅酶A的终浓度为1mM和5mM。5.根据权利要求3所述的应用，其特征在于：羽衣甘蓝花朵进入成熟蕾期时，进行人工去雄，利用手术刀将成熟柱头下方花柱2
‑
3毫米处切断，并将花柱插...

【专利技术属性】
技术研发人员：蓝兴国，秦洪涛，荀宝茹，张雪，李兰兰，
申请(专利权)人：东北林业大学，
类型：发明
国别省市：