滑液囊支原体rMSPB截短蛋白及MS抗体ELISA检测试剂盒及应用制造技术

本发明专利技术提供了滑液囊支原体rMSPB截短蛋白及MS抗体ELISA检测试剂盒及应用，所述rMSPB截短蛋白为SEQ ID NO.1所示核苷酸序列编码的蛋白。滑液囊支原体抗体ELISA检测试剂盒包括用滑液囊支原体重组rMSPB截短蛋白包被的支持介质。本发明专利技术提供的试剂盒明显优于其他蛋白或MS全菌包被后的检测效果，可用于MS抗体水平的准确监测、感染状况的准确检测，特别地可用于活疫苗免疫与临床感染菌株的鉴别检验，利于种鸡场MS净化；也可用于其他靶动物如鸽子血清MS抗体的检测和健康评估，能有效避免假阴性及漏检。检。

【技术实现步骤摘要】
滑液囊支原体rMSPB截短蛋白及MS抗体ELISA检测试剂盒及应用


[0001]本专利技术属于生物医药
，具体涉及一种滑液囊支原体rMSPB截短蛋白及MS抗体ELISA检测试剂盒及应用。

技术介绍

[0002]滑液囊支原体(Mycoplasma synoviae，MS)是禽类致病性支原体之一，主要感染鸡、火鸡、鸽子等。家禽感染MS后主要表现鸡足垫肿胀，关节渗出性的滑液囊膜及腱鞘滑膜炎，还可引起呼吸道症状及气囊炎，MS感染可使鸡群淘汰率增加、肉鸡胴体品质差、蛋鸡产蛋率下降等。MS对各个年龄的鸡、火鸡均能感染，但雏鸡感染性最高，一旦感染大多终身带菌。MS临床上常与NDV、IBV、大肠杆菌等病原混合感染。MS感染已成为危害养鸡业发展的重要疫病。
[0003]目前，MS抗体的检测方法包括平板凝集试验(RSA)、血凝抑制试验(IHA)、酶联免疫吸附试验(ELISA)等。RSA操作简便，但其同鸡毒支原体抗体存在交叉反应；IHA特异性良好，也可用于鸡毒支原体(MG)和MS的鉴别诊断，但其需要新鲜的鸡红细胞且现用现配，操作比较繁琐。目前，还无商品化MS ELISA抗体检测试剂盒获批，国外IDEXX公司有MS ELISA抗体检测试剂盒在国内销售，但该试剂盒所包被的MS抗原与国内MS流行菌株有显著差异，在国内不同种禽场MS临床检测、净化应用中效果欠佳。

技术实现思路

[0004]为了解决上述技术问题，本专利技术提供一种滑液囊支原体重组rMSPB截短蛋白，以及含该重组蛋白的MS间接ELISA抗体检测试剂盒及其制备方法与应用。
[0005]为实现上述目的，本专利技术采用以下的技术方案为：
[0006]一种滑液囊支原体重组rMSPB截短蛋白，所述rMSPB截短蛋白为SEQ ID NO.1所示核苷酸序列编码的蛋白。
[0007]如上所述的滑液囊支原体重组rMSPB截短蛋白的制备方法，其包括先采用引物对SEQ ID NO.8和SEQ ID NO.11所示的序列对SEQ ID NO.1所述序列扩增或滑液囊支原体的基因组为模板进行扩增并回收，采用同源臂上游引物SEQ ID NO.12和SEQ ID NO.13对回收的模板添加同源臂，将同源臂回收产物与pET
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28a载体进行同源重组获得连接产物，将连接产物加入感受态细胞，转染后培养，鉴定后获得含阳性的重组pET
‑
28a
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mspb的质粒，将质粒转入感受态细胞，获的阳性菌落，将阳性菌落培养诱导后获得滑液囊支原体重组rMSPB截短蛋白。
[0008]一种滑液囊支原体抗体ELISA检测试剂盒，其包括用滑液囊支原体重组rMSPB截短蛋白包被的支持介质，所述滑液囊支原体重组rMSPB截短蛋白为SEQ ID NO.1所示核苷酸序列编码的蛋白。
[0009]如上所述的ELISA检测试剂盒，优选地，还包括酶标记物以及用于滑液囊支原体抗
原抗体的检测试剂、样品稀释液、阴性对照、阳性对照、显色液和终止液，所述酶标记物为含针对所检抗体的酶标记抗体溶液。
[0010]如上所述的ELISA检测试剂盒，优选地，滑液囊支原体重组rMSPB截短蛋白的包被浓度为0.0016～5μg/ml，优选为0.2～5μg/ml，更优选为0.2μg/ml；每孔100～200μl；支持介质为微量滴定板。
[0011]如上所述的ELISA检测试剂盒，优选地，滑液囊支原体重组rMSPB截短蛋白的包被抗原浓度为0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0、1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2.0、2.1、2.2、2.3、2.4、2.5、2.6、2.7、2.8、2.9、3.0、3.1、3.2、3.3、3.4、3.5、3.6、3.7、3.8、3.9、4.0、4.1、4.2、4.3、4.4、4.5、4.6、4.7、4.8、4.9、5μg/ml。
[0012]如上所述的ELISA检测试剂盒，优选地，酶标记物为辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶或β
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D
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半乳糖甘酶标记兔抗鸡抗体的溶液，酶标记物所用的酶标稀释液为每升双蒸水中含6.06g Tris、8～12gBSA、0.1ml Tween
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20、0.5ml ProClin300；进一步地，BSA最优选为10g；酶标记物与酶标稀释液按1∶20000～1∶100000稀释，进一步优选为1∶20000～1∶40000稀释，更优选为1∶40000稀释。
[0013]如上所述的ELISA检测试剂盒，优选地，所述样品稀释液配方为每升双蒸水中含80g NaCl、2g K2HPO4、29g Na2HPO4·
12H2O、2g KCl、2～8g BSA、0.5ml ProClin300和5ml Tween
‑
20；进一步地，所述BSA优选为2g、3g、4g、5g、6g、7g或8g；进一步地，所述BSA更优选为5g。
[0014]如上所述的ELISA检测试剂盒，优选地，使用时，待检样品用样品稀释液进行稀释，所述样品稀释倍数为1∶50～1∶400，进一步优选为1∶400。
[0015]如上所述的ELISA检测试剂盒，优选地，所述显色液的配制方法：先取0.3g TMB溶于40ml N
‑
甲基甲基吡咯烷酮中，再取0.05g二乙烯三胺五乙酸、10.0gβ
‑
环糊精、14.0g无水柠檬酸、10.0g二水柠檬酸三钠、1.0g核糖、0.08g氯化钙、0.3g过氧化脲溶于850ml双蒸水中，搅拌至完全溶解后，加入TMB混匀，加双蒸水定容至1L。
[0016]如上所述的ELISA检测试剂盒，优选地，所述阳性对照为滑液囊支原体免疫SPF鸡血清，所述阴性对照为未感染滑液囊支原体的SPF鸡血清。
[0017]如上所述的ELISA检测试剂盒，优选地，所述试剂盒还包括终止液、洗涤液，所述终止液为2M H2SO4溶液，所述洗涤液为含0.05％v/v的Tween
‑
20和0.005％v/v的Proclin300的磷酸盐缓冲液。
[0018]如上所述滑液囊支原体抗体ELISA检测试剂盒的制备方法，优选地，其包括如下步骤：
[0019]1)用基因工程手段制备序列表中编码的滑液囊支原体重组rMSPB截短蛋白，用包被缓冲液稀释至包被浓度0.0016～5μg/ml，100μl/孔包被于微量滴定板，2～8℃包被16～24小时或37℃包被2小时后洗涤、封闭、干燥；
[0020]2)酶标记兔抗鸡抗体用酶标稀释液按1∶20000～1∶100000稀释作为酶标记物；
[0021]3)分别制备样品稀释液、洗涤液、阳性对照、阴性对照、显色液、终止液；
[0022]4)将步骤1)包被的微量滴定板、所述步骤2)的酶标记物及所述步骤3)制备的样品稀释液、洗涤液、阳性对照、阴性对照、显色液、终止液组装成试剂盒。
...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种滑液囊支原体重组rMSPB截短蛋白，其特征在于，所述rMSPB截短蛋白为SEQ ID NO.1所示核苷酸序列编码的蛋白。2.一种滑液囊支原体抗体ELISA检测试剂盒，其特征在于，其包括用滑液囊支原体重组rMSPB截短蛋白包被的支持介质，所述滑液囊支原体重组rMSPB截短蛋白为SEQ ID NO.1所示核苷酸序列编码的蛋白。3.根据权利要求2所述的ELISA检测试剂盒，其特征在于，还包括酶标记物以及用于滑液囊支原体抗原抗体的检测试剂、样品稀释液、阴性对照、阳性对照、显色液和终止液，所述酶标记物为含针对所检抗体的酶标记抗体溶液。4.根据权利要求2所述的ELISA检测试剂盒，其特征在于，所述滑液囊支原体重组rMSPB截短蛋白的包被浓度为0.0016～5μg/ml，每孔100～200μl；所述支持介质为微量滴定板。5.根据权利要求3所述的ELISA检测试剂盒，其特征在于，所述酶标记物为辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶或β
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D
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半乳糖甘酶标记兔抗鸡抗体的溶液，所述酶标记物所用的酶标稀释液为每升双蒸水中含6.06g Tris、8～12gBSA、0.1ml Tween
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20、0.5ml ProClin300；所述酶标记物与所述酶标稀释液按1∶20000～1∶100000稀释。6.根据权利要求3所述的ELISA检测试剂盒，其特征在于，所述样品稀释液配方为每升双蒸水中含80g NaCl、2g K2HPO4、29g Na2HPO4·
12H2O、2g KCl、2～8g BSA、0.5ml ProClin300和5ml Tween
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20。7.根据权利要求3所述的ELISA检测试剂盒，其特征在于，所述显色液的配制方法：先取0.3g TMB溶于40ml N
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甲基甲基吡咯烷...

【专利技术属性】
技术研发人员：王晶钰，韩水仲，王莹，畅文驰，韩静静，王立珍，
申请(专利权)人：洛阳职业技术学院，
类型：发明
国别省市：