一种水稻组织特异性表达启动子及其应用制造技术

本发明专利技术涉及一种水稻组织特异性表达启动子及其应用。具体地，本发明专利技术提供了能够在植物组织中表达的强启动子Os18R核酸序列及制备和使用方法。本发明专利技术首次揭示植物基因启动子区反向序列具有强组成型启动子功能元件。还涉及含有该启动子的表达盒、重组表达载体。本发明专利技术所公开的Os18R启动子在植物的根、茎、叶片、颖壳等器官中都表现很强的活性，而在花蕊、胚和胚乳中不表达，在植物转基因领域具有很好的应用前景。前景。

【技术实现步骤摘要】
一种水稻组织特异性表达启动子及其应用


[0001]本专利技术属于生物技术和基因工程
，具体涉及一种水稻组织特异性表达启动子及其应用。

技术介绍

[0002]启动子作为基因转录过程中的关键调节因子，在植物基因工程中起着重要的作用(Xue etal.,2018)。常见的启动子主要分为三种类型：组成型、诱导型和组织特异型。组成型启动子通常用于分析基因功能和性状修饰，能够引起外源基因在植株中获得稳定的表达水平(Mitsuko et al.,2019)。目前组成型强启动子应用最为广泛的3个启动子分别是35S、Actin和Ubiquitin(Yanet al.,2005；He et al.,2009；Kishi
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kaboshi et al.,2017)。但是，大量高效、时续驱动外源基因的表达其实对植物生长不仅没有必要，而且会消耗植物体内大量的营养，还会对植物的生长发育产生负面影响(Lietal.,2020)，包括组成型启动子的转录往往会抑制植物生长(Jeongetal.,2015)。组织特异启动子，一般都是特定组织、器官或特定的发育阶段的表达基因的一段5'
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UTR，它们能够有效地避免对植物生长发育带来负面影响(Xue et al.,2018)。尽管有一些组织特异表达启动子已被克隆，主要包括根(Li et al.,2019)、叶鞘(Oshimaetal.,2019)、韧皮部(Duttetal.,2012)、花粉粒(Wangetal.,2020)、胚(Kimetal.,2011)、胚乳(Pattietal.,2012)及组织部分(Yeetal.,2012；Yangetal.,2014；Manikandanetal.,2016；Bai etal.,2020)等，但是仅仅一小部分的顺式作用元件的作用被认识(Caietal.,2008)。此外，目前已经克隆的组织特异表达启动子主要是一些与光诱导和光合系统紧密关联的基因，参与植物光合作用，实现光能转化为糖的功能(Liu etal.,2018)，例如：rbcS(Matsuokaetal.,1994)，DX1(Yeetal.,2012)，D540(Caietal.,2007)等启动子。分离、鉴定非光合作用系统相关的水稻组织特异表达启动子有利于避免受光效应的影响，应用范围更为广泛。

技术实现思路

[0003]本专利技术的目的是提供一种水稻组织特异性表达启动子及其应用。
[0004]本专利技术的目的是通过如下技术方案来实现的：一种水稻组织特异性表达启动子Os18R，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
[0005]一组用于扩增上述水稻组织特异性表达启动子Os18R的引物对，其核苷酸序列为：Os18R
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2000F：5'
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TTTAGATTAGCTATTTGACTTATTT
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3'，Os18R
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2000R：5'
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cccccccgcctccgcctccgcctTCG
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3'。
[0006]一种表达盒，其是利用上述的水稻组织特异性表达启动子Os18R与目的基因连接所构建而得。
[0007]一种重组表达载体，其含有上述的水稻组织特异性表达启动子Os18R。
[0008]一种转化子，其包含上述的重组表达载体，所述转化子为细胞系或愈伤组织或转基因植株。
[0009]上述一种水稻组织特异性表达启动子Os18R在调控或启动目的异源基因在水稻组织中进行特异性表达中的应用，所述水稻组织为根、茎、叶片、叶鞘、颖壳。
[0010]上述一种水稻组织特异性表达启动子Os18R在改良水稻性状或培育转基因水稻新品种中的应用。
[0011]本专利技术的显著优点在于：本专利技术提供了一种水稻组织表达强特异启动子，且与传统启动子不同的是该启子功能元件来源于基因上游启动子区域的反向序列，并在植物的根、茎、叶、颖壳等器官中都表现很强的活性，而在花蕊、胚和胚乳中不表达，在植物转基因领域具有很好的应用前景。
附图说明
[0012]图1：水稻启动子Os18R全长2000bp所在LOC_Os05g05580基因区域。
[0013]图2：重组表达载体pCXOs18R的构建。
[0014]图3：水稻不同组织器官GUS和Actin基因的表达模式。
[0015]图4：水稻不同组织器官的GUS组织染色。
具体实施方式
[0016]以下的实施例便于更好地理解本专利技术，但并不限定本专利技术。下述实施例中所使用的实验验方法如没有特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所使用的的实验材料如无特别说明均为市售购买产品。
[0017]实施例1：利用CTAB法提取日本晴水稻基因组DNA。
[0018]以生物信息学网站(http://rice.plantbiology.msu.edu/)上提取LOC_Os05g05580基因组信息，获得其基因5
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区反向序列作为启动子区域(图1)的基因序列，共计2000bp长度，设计合成水稻启动子Os18R克隆引物Os18R
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2000F和Os18R
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2000R(表1)。以日本晴水稻基因组DNA为模板，PCR扩增水稻启动子Os18R序列；反应体系：10*KOD buffer2μl，10mM dNTP 1.5μl，10mM引物Os18R
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2000F 2μl，10mM引物Os18R
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2000R 2μl，日本晴水稻基因组DNA 2μl，KOD polymerase 1μl，用双蒸水补液至50μl；反应条件：94℃5min；98℃30s，58.5℃30s，72℃2min 30s，35个循环；72℃10min。利用琼脂糖凝胶电泳对PCR产物进行检测，产物预期大小为2000bp，将预期目的条带进行凝胶回收，回收产物与pCXGUS
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P质粒于16℃连接12h，然后转化入大肠杆菌DH5α感受态细胞，挑选单克隆菌落用含有Kan的LB培养基扩大培养，后用高纯度质粒提取试剂盒提取质粒，挑选阳性克隆测序。结果表明，水稻启动子Os18R全长2000bp，核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，其与组织特异表达相关的顺式作用元件如表2所示。
[0019]表1水稻启动子Os18R克隆引物序列引物名称引物序列(5'
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3')Os18R
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2000FTTTAGATTAGCTATTTGACTTATTTOs18R
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2000RCCCCCCCGCCTCCGCCTCCGCCTTCG表2水稻启动子Os18R序列中与组织特异表达相关的顺式作用元件
为方便与载体相连接，将测序正确的水稻启动子Os18R的回收产物加A尾，得到带A尾的水稻启动子Os18R，加A尾的反应体系：天根10*buffer 1.5μL，2.5mM dNTP 1.5μL，天根Taq酶0.5μ本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种水稻组织特异性表达启动子Os18R，其特征在于：核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。2.一组用于扩增如权利要求1所述的水稻组织特异性表达启动子Os18R的引物对，其特征在于：核苷酸序列为：Os18R
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2000F：5'
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TTTAGATTAGCTATTTGACTTATTT
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3'，Os18R
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2000R：5'
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cccccccgcctccgcctccgcctTCG
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3'。3.一种表达盒，其特征在于：利用如权利要求1...

【专利技术属性】
技术研发人员：林智敏，方少忠，
申请(专利权)人：福建省农业科学院生物技术研究所，
类型：发明
国别省市：