增强牛分枝杆菌细胞质蛋白质谱检出率与可信度的方法技术

本发明专利技术提供了一种增强牛分枝杆菌减毒株Mycobacterium bovis strain BCG,subscrain 1173P2细胞质蛋白质谱检出率与可信度的方法，首先制备分子构型、空间构象、表面电荷和亲疏水性基团各不相同的仿生亲和填料，置于重力柱中，形成仿生亲和色谱柱；然后通过大肠杆菌E.coli

【技术实现步骤摘要】
增强牛分枝杆菌细胞质蛋白质谱检出率与可信度的方法


[0001]本专利技术属于病原微生物蛋白质组学
，具体涉及一种增强牛分枝杆菌减毒株Mycobacterium bovis strain BCG,subscrain 1173P2细胞质蛋白表达谱的液相色谱
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质谱法(Liquid chromatography
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tandem mass spectrometry,LC
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MS/MS)的蛋白检出率及其可信度的检测、分析与评估的方法。

技术介绍

[0002]蛋白质组学研究是细胞、组织或机体全部基因在某个时间表达的所有蛋白质的组成成分，在疾病蛋白标志物筛选中起着极其重要的作用。复杂混合物蛋白质组学研究的技术包括：(1)混合蛋白样本直接质谱分析其蛋白组成，未对样本做任何预分组或前处理；(2)基于凝胶层析的分组方法，包括双向凝胶电泳
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液相色谱
‑
质谱的方法分析样本的蛋白组成。
[0003]牛分枝杆菌减毒株蛋白组分复杂，不同蛋白在混合物中的浓度差异极大。复杂蛋白混合物蛋白质组学研究方法中较为经典的是基于十二烷基磺酸钠
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聚丙烯酰胺凝胶电泳(Dodecyl sulfate,sodium salt(SDS)
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Polyacrylamide gel electrophoresis,SDS
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PAGE)分离待测物，再用液相色谱
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质谱/质谱(LC
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MS/MS)方法检测其组分。此方法简单、快速，但有以下局限性：(1)对极端分子量(Molecular weight,Mw,Mw>120kDa或Mw<10kDa)蛋白质和膜蛋白质分离效果差，易导致其质谱分析时漏检；(2)SDS
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PAGE考马斯亮蓝染色后显色灵敏度最低为0.2μg/mL，因此混合物中浓度低于此值的蛋白质易漏检；(3)质谱检测时样本中的低丰度蛋白质检测信号极易被高丰度蛋白质所掩盖，而前期的研究结果表明，结核分枝杆菌的培养滤液蛋白(Culture filtrate proteins of Mycobacterium tuberculosis,MTB
‑
CFPs)中极高丰度与极低丰度蛋白质间差异约达10
10
；尽管高丰度蛋白质在牛分枝杆菌减毒株Mycobacterium bovis strain BCG,subscrain 1173P2生长发育中起重要作用，但大量低丰度蛋白质在菌体适应外环境变化、基因表达调控、细胞中氧化还原、电子传递等多种生物化学反应中发挥作用。因此，如何将混合样本中极低丰度蛋白质与高丰度蛋白质分离，增强样本中低丰度蛋白液相色谱
‑
质谱蛋白检出率是包括牛分枝杆菌减毒株Mycobacterium bovis strain BCG,subscrain 1173P2在内的复杂蛋白混合物蛋白质组学研究的挑战之一。

技术实现思路

[0004]本专利技术所要解决的技术问题在于针对上述现有技术的不足，提供一种增强液相色谱
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串联质谱(LC
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MS/MS)检测牛分枝杆菌减毒株Mycobacterium bovis strain BCG,subscrain 1173P2细胞质蛋白表达谱的液相色谱
‑
串联质谱检测方法。该方法将牛分枝杆菌减毒株Mycobacterium bovis strain BCG,subscrain 1173P2细胞质蛋白选择性吸附到仿生亲和色谱柱上，通过SDS
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PAGE电泳分析吸附蛋白的差异性大小；高丰度蛋白选择性分配到不同组分中，使其他蛋白，尤其是中低丰度的蛋白可以有效富集，降低高丰度蛋白对其
质谱检测时的屏蔽效应，增加低丰度蛋白的质谱检出率。牛分枝杆菌减毒株Mycobacterium bovis strain BCG,subscrain1173P2细胞质蛋白组学研究将进一步促进对结核病疫苗的开发及筛选出特异性结核杆菌细胞的生物标志物的深入研究。
[0005]为解决上述技术问题，本专利技术采用的技术方案是：一种增强牛分枝杆菌减毒株Mycobacterium bovis strain BCG,subscrain 1173P2细胞质蛋白质谱检出率与可信度的方法，该方法为：
[0006]S1、仿生亲和填料的制备：用化学合成方法将含氨基小分子化合物偶联到经环氧氯丙烷活化的琼脂糖凝胶6FF上，得到仿生亲和填料；
[0007]S2、牛分枝杆菌减毒株Mycobacterium bovis strain BCG,subscrain1173P2细胞质蛋白的制备：取牛分枝杆菌减毒株Mycobacterium bovis strain BCG,subscrain 1173P2进行细胞复苏，用接种环将复苏后的牛分枝杆菌减毒株Mycobacterium bovis strain BCG,subscrain 1173P2菌株转接到苏通液体培养基中增菌培养，得到牛分枝杆菌减毒株Mycobacterium bovis strain BCG,subscrain 1173P2细菌；将牛分枝杆菌减毒株Mycobacterium bovis strain BCG,subscrain 1173P2细菌在65℃的条件下按5min/次的频率热灭活三次；取热灭活后的牛分枝杆菌减毒株Mycobacterium bovis strain BCG,subscrain 1173P2，用10mM pH7.4的PBS溶液重悬菌体，离心，弃掉上清液，保留菌体，重复3次；然后超声波破碎细菌细胞壁，离心，收集上层透亮液体，得到牛分枝杆菌减毒株Mycobacterium bovis strain BCG,subscrain 1173P2细胞质蛋白；
[0008]S3、仿生亲和分组：将S1得到的仿生亲和填料置于重力柱中，形成仿生亲和色谱柱；分别对大肠杆菌E.coli
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DH5
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α和耻垢分枝杆菌Mycobacterium smegmatis mc2155细胞质蛋白进行仿生亲和分组，通过SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳法评估不同仿生亲和色谱柱对两种细胞质蛋白的吸附性能，筛选出具有吸附差异性的仿生亲和填料；筛选后的仿生亲和填料用于S2得到的牛分枝杆菌减毒株Mycobacterium bovis strain BCG,subscrain 1173P2细胞质蛋白的仿生亲和分组；
[0009]所述仿生亲和分组的步骤为：
[0010]S301、仿生亲和色谱柱的装柱：取仿生亲和填料1.0
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1.5mL填装到20mL的色谱柱内；
[0011]S302、仿生亲和色谱柱平衡：用ddH2O和10mM pH7.4的PBS溶液分别冲洗仿生亲和填料10
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20次；
[0012]S303、上样：本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1173P2细胞质蛋白进行生物信息学分析。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，S1所述含氨基小分子化合物包括但不限于：对氨基苯乙酮、2
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氨基苯并咪唑、L
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酪氨酸、4,4
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二氨基二苯醚、2,6
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二氨基吡啶、L
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精氨酸、5
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氨基间苯二甲酸、4
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叔丁基苄胺、1,10
‑
二氨基癸烷、γ
‑
氨基丁酸、L
‑
茶氨酸、3
‑
氨基苯酚、4
‑
氨基
‑1‑
萘酚盐酸盐、对氨基苯酚、己胺、L
‑
二苯胺、吡嗪酰胺、L
‑
丝氨酸或4
‑
(2
‑
...

【专利技术属性】
技术研发人员：马国荣，罗鹏征，马锐，王佩，徐锐强，杨壤，赵志浩，李雅婷，许晨冉，王梦玲，
申请(专利权)人：宁夏医科大学，
类型：发明
国别省市：