用于同步检测P16和Ki67的量子点免疫荧光试剂条的制备方法及应用技术

本发明专利技术属于生物检测技术领域，涉及一种用于同步检测P16和Ki67的量子点免疫荧光试剂条的制备方法，包括：先用偶联缓冲液对P16和Ki67进行偶联标记，得到QD

【技术实现步骤摘要】
用于同步检测P16和Ki67的量子点免疫荧光试剂条的制备方法及应用


[0001]本专利技术属于生物检测
，涉及荧光试剂条，尤其涉及一种用于同步检测P16和Ki67的量子点免疫荧光试剂条的制备方法及应用。

技术介绍

[0002]宫颈癌是妇科最常见的恶性肿瘤之一，全球发病率仅次于乳腺癌居第2位，据2000年世界范围内统计，每年大约有50万左右的新发病例，中国每年新发病例约15万左右，8万人死于宫颈癌，因此提高宫颈癌的早期诊断水平对于宫颈癌的预后有重要意义。传统的宫颈癌诊断方法包括影像学检查、肿瘤标志物测定、细胞学检查和病理组织活检等。传统检查方法固然有其实用性，但也存在弊端，因此，建立新的诊断和筛查技术对降低宫颈癌的死亡率至关重要。
[0003]P16是在人染色体9p21中发现的第一个直接参与细胞周期调控的抑癌基因，无论是在宫颈癌前病变中还是在宫颈癌中都会具有高表达。p16蛋白是一种细胞周期依赖性蛋白激酶抑制剂，直接参与细胞周期调控，通过与特异性周期蛋白D1(cyclinD1)以竞争方式结合CDK4的活性，抑制CDK4的活性，从而阻止Rb蛋白的磷酸化，最终使细胞停止于G0期或G1期，而抑制细胞分裂、增殖。ki67是一种细胞核抗原和增殖标志物，表达于细胞周期所有活动阶段的G1、S、G2和M期，在Go期细胞不表达，由于其半衰期短，不易受生长因子诱导，可作为评价细胞生长分数的指标。生理条件下p16和ki67在同一细胞内的表达互排斥，若这两种指标同时表达，则提示细胞周期调控失调，且多发生在CINⅡ级中，这是HPV DNA与宿主细胞相整合导致的结果。
[0004]现有的检测试剂盒在宫颈癌筛查中，单次通过免疫细胞化学的方法仅检测P16基因或者仅检测Ki
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67基因，检测费时费力，需要同时处理两个样本，然后进行检测获得结果，较为复杂。量子点(quantum dots，QD)是一种半导体纳米晶，其粒径介于1～10nm之间，具有较强的抗漂白能力，荧光性、生物相容性好，能够同时激发多种荧光颜色，有望替代传统的有机荧光染料，是非常理想的荧光材料，正如专利CN112083160A中所公开的可用于制备高品质的荧光探针，来实现同步检测宫颈癌细胞上的P16和Ki67蛋白。本专利技术采用量子点作为荧光信号来构建特异性探针，制备出一种可同时检测p16和ki
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67的量子点免疫层析试剂条，从而实现宫颈癌的早期诊断。

技术实现思路

[0005]本专利技术所要解决的技术问题在于，提供一种用于同步检测P16和Ki67的量子点免疫荧光试剂条的制备方法，并公开了所述量子点试剂条的应用。
[0006]本专利技术解决上述技术问题所采取的技术方案是：
[0007]一种用于同步检测P16和Ki67的量子点免疫荧光试剂条的制备方法，包括如下步骤：
[0008]A.取10μL量子点置于离心管中，加入60μL偶联缓冲液，混匀后加入30μL 1mg/mL 1
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乙基
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(3
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二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺(EDC)和100μL 1mg/mL N
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羟基硫代琥珀酰亚胺(NHS)进行活化，相应的分别加入0.12mL浓度为0.1mg/mL的P16标记抗体和0.08mL浓度为0.15mg/mL的Ki67标记抗体进行偶联标记，并将其置于水浴恒温振荡器中震荡4h，反应结束后加入15μL封闭液封闭1h；离心除去上清液，加入保存液进行超声重悬得到QD
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P16偶联物和QD
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Ki67偶联物，静置过夜，4℃保存备用；
[0009]B.将P16抗体、Ki67抗体、羊抗鼠IgG抗体用包被液稀释到0.3～2mg/mL，按顺序包被在硝酸纤维素膜上形成检测线T1、检测线T2、质控线C；
[0010]C.将步骤A所制得的QD
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P16偶联物和QD
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Ki67偶联物喷涂于结合垫的表面，晾干；
[0011]D.取底板，将样品垫、步骤C所述结合垫、步骤B所述硝酸纤维素膜和吸水垫自前向后依次粘贴于底板上，其中，结合垫覆盖于硝酸纤维膜的前部，样品垫压住结合垫的一部分，吸水垫覆盖于硝酸纤维素膜的后部，切割成长条，制得同步检测P16和Ki67的量子点免疫荧光试纸条。
[0012]本专利技术较优公开例中，步骤A中所述量子点为表面修饰有羧基的水溶性量子点，优选CdSe/ZnS量子点。
[0013]本专利技术较优公开例中，步骤A中所述偶联缓冲液为5mM pH5.5 2
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(N
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吗啡啉)乙磺酸缓冲液(MES)。
[0014]本专利技术较优公开例中，步骤A中所述封闭液包含有5mM BS其pH 8.0、10wt％甘氨酸和0.01wt％吐温
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20。
[0015]本专利技术较优公开例中，步骤A中所述保存液包含有0.5wt％的甘氨酸、0.3wt％的碳酸钾、1wt％的BSA和8wt％的蔗糖。
[0016]本专利技术较优公开例中，步骤B中所述包被液包含有20mM PB其pH 7.4，和5wt％蔗糖。
[0017]本专利技术较优公开例中，步骤B中所述的硝酸纤维素膜为CN140、CN95、HF120、HF135中的任一种。
[0018]本专利技术较优公开例中，步骤C中所述将QD
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P16偶联物和QD
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Ki67偶联物喷涂于结合垫的表面，是先将QD
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P16偶联物和QD
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Ki67偶联物浓缩一倍后按体积比1:1混合，使用XYZ三维划膜仪进行喷金，喷金浓度为3μL/cm。
[0019]本专利技术较优公开例中，步骤D中所述样品垫为玻璃纤维膜，表面滴加预处理液进行润湿预处理，所述预处理液中主要包含有2mM硼酸盐缓冲液其pH 8.0、1wt％吐温
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20、2wt％蔗糖、1wt％酪蛋白和0.5wt％PVP。
[0020]本专利技术还公开了所制得的试剂条的应用，即用于同时检测P16和Ki67两种蛋白，其中P16的检测极限至1ng/mL，Ki67的检测极限至0.3ng/mL。
[0021]该试剂条提高了实验人员的病理阅片的准确性，便于观察，检测准确率提高，降低了假阳性及假阴性的可能，有效满足了人们的使用需求。
[0022]有益效果
[0023]本专利技术公开一种用于同步检测P16和Ki67的量子点免疫荧光试剂盒的制备及应用。该试剂盒以量子点为荧光信号，分别偶联标记P16和Ki67两种抗体蛋白，并将P16、Ki67和羊抗鼠IgG包被在硝酸纤维素膜上，采用免疫层析双抗夹心法原理，利用特异性抗体的特
异性结合同时检测宫颈癌细胞上的两种标志物，用于宫颈癌和癌前病变的早期诊断。本专利技术制备得到的量子点免疫荧光试剂盒，检测时间短，检测准确性高，降低了假阳性以及假阴性的可能，有效满足了人们的使用需求，在宫颈癌诊断中具有广阔的应用前景。实现了一次取样可同时检测P1本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种用于同步检测P16和Ki67的量子点免疫荧光试剂条的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：A.取10μL量子点置于离心管中，加入60μL偶联缓冲液，混匀后加入30μL 1mg/mLEDC和100μL 1mg/mL NHS进行活化，相应的分别加入0.12mL浓度为0.1mg/mL的P16标记抗体和0.08mL浓度为0.15mg/mL的Ki67标记抗体进行偶联标记，并将其置于水浴恒温振荡器中震荡4h，反应结束后加入15μL封闭液封闭1h；离心除去上清液，加入保存液进行超声重悬得到QD
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P16偶联物和QD
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Ki67偶联物，静置过夜，4℃保存备用；B.将P16抗体、Ki67抗体、羊抗鼠IgG抗体用包被液稀释到0.3～2mg/mL，按顺序包被在硝酸纤维素膜(4)上形成检测线T1(6
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1)、检测线T2(6
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2)、质控线C(7)；C.将步骤A所制得的QD
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P16偶联物和QD
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Ki67偶联物喷涂于结合垫(3)的表面，晾干；D.取底板(1)，将样品垫(2)、步骤C所述结合垫(3)、步骤B所述硝酸纤维素膜(4)和吸水垫(5)自前向后依次粘贴于底板(1)上，其中，结合垫(3)覆盖于硝酸纤维膜(4)的前部，样品垫(2)压住结合垫(5)的一部分，吸水垫(5)覆盖于硝酸纤维素膜(4)的后部，切割成长条，即得。2.根据权利要求1所述的用于同步检测P16和Ki67的量子点免疫荧光试剂条的制备方法，其特征在于：步骤A中所述量子点为表面修饰有羧基的水溶性量子点，优选CdSe/ZnS量子点。3.根据权利要求1所述的用于同步检测P16和Ki67的量子点免疫荧光试剂条的制备方法，其特征在于：步骤A中所述偶联缓冲液为5mM pH5.5 2
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(N
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吗啡啉)乙磺酸缓冲液(ME...

【专利技术属性】
技术研发人员：冯颖淑，刘强，刘宏飞，
申请(专利权)人：镇江市高等专科学校，
类型：发明
国别省市：