基于五芯光纤主动光操控的数字扫描光片荧光显微成像系统技术方案

本发明专利技术提供的是一种基于五芯光纤主动光操控的数字扫描光片荧光显微成像系统。其特征是：使用多芯光纤光镊以非接触、无损伤的方式对处于液态环境中的活体单细胞绕特定转动轴转动角度进行稳定而精准的主动光操控。在细胞转动过程中，基于全息波前整形方法优化经多芯光纤传输的贝塞尔光束，在细胞内部快速扫描形成虚拟光片，激发产生的荧光信号由与虚拟光片激发光平面垂直的显微物镜收集，通过CMOS相机记录活体单细胞不同角度的荧光层析图像。本发明专利技术可实现实时原位获取活体单细胞内部三维结构的高分辨率的荧光层析图像，具有高精度、高分辨率、高可靠性、高灵活性和适用性强等特点，在生物学、医学和生命科学等众多研究领域中具有广泛的应用前景。有广泛的应用前景。有广泛的应用前景。

【技术实现步骤摘要】
基于五芯光纤主动光操控的数字扫描光片荧光显微成像系统


[0001]本专利技术提供的是一种基于五芯光纤主动光操控的数字扫描光片荧光显微成像系统。通过五芯光纤的四芯稳定捕获细胞，并精准操控活体细胞的旋转角度，中间纤芯实现对细胞进行片状光束快速扫描，进而获取高时间和空间分辨率的细胞三维结构层析图像，属于光操控和光学显微成像领域。。

技术介绍

[0002]对于细胞的研究遵循着科学发展的规律不断深入和发展，经历了细胞水平、亚细胞水平和分子水平等不同研究层次。随着研究的深入，我们所面临的挑战是以展开生命活动的大环境活细胞作为“试管”，在尽量避免影响细胞自身性质及其所处微环境的前提下，以非接触、无损伤的方式获取活体单细胞的亚细胞精细结构图像信息，细胞生命过程中不同种类生物分子的空间分布及其变化信息，以及细胞器和生物分子、不同种类生物分子之间相互作用过程的功能信息，为在更深层次上揭示生命活动的本质和基本规律提供可靠的科学依据。为实现这一目标，要求检测手段具有分子水平的识别能力，亚微米乃至纳米尺度的空间分辨率，高探测灵敏度，以及毫秒或更高的时间分辨能力。
[0003]因此，研究和发展一种在不影响细胞自身其性质及其所处微环境的前提下，通过非接触、无损伤的方式对细胞姿态精准主动光操控，实现实时原位获取具有高时间和空间分辨率的，活体单细胞内部三维结构荧光层析图像，并对其生命活动过程进行长时间动态定量监测的光片荧光显微层析成像方法和定量分析研究平台，对于研究单细胞的生命活动过程，外界环境对细胞内生物分子的性质、功能和作用的影响，进而探寻生物分子在细胞生命活动过程中的性质、功能及其相互作用动态过程等方面具有重要意义。
[0004]随着荧光标记技术、激光技术、微弱信号探测技术和计算机技术的发展，现代显微成像技术能够以前所未有的时间和空间分辨率记录生物系统的时空信息，改变我们看待、记录、解释和理解生物事件的方式。特别是基于自体荧光或通过荧光标记提供高的化学特异性和成像对比度的宽场荧光显微技术(Wide
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field Fluorescence Microscopy，WFM)成为研究活体单细胞，获取其内部精细三维结构和定量功能信息的重要研究工具。然而，通过WFM获得的图像中包含了大量离焦的荧光信号，大大降低了图像对比度，因此无法获取具有高空间分辨率的三维结构荧光层析图像。将激光光束扫描和共焦探测结合在一起的激光扫描共焦荧光显微技术(Laser Scanning Confocal Fluorescence Microscopy，LSCM)，利用安装在光电探测器共轭位置处的共焦针孔有效消除离焦荧光信号的影响，从而实现具有高空间分辨率的三维光学层析成像。
[0005]在LSCM系统中，待测样品沿激发光传输光路的焦平面附近区域的荧光团均被激发，大大降低了激发效率。其次，样品中的许多内源性荧光和非荧光有机成分也会被激发。在对待测活体生物样品进行长时间成像过程中，连续长时间照射引起的光毒性、光损伤和光致漂白等是其无法回避的问题。此外，在系统中使用激光光束扫描和在探测器前安装共焦针孔，导致系统结构复杂，造价昂贵，成像时间长。因此，广大科研工作者一直致力于开发
一种能够在较长观察时间内，快速获取较大体积的活体单细胞具有高时空分辨率三维结构荧光层析图像的显微成像方法。
[0006]近年来，使用薄片状激光束实现的光片荧光显微技术(Light Sheet Fluorescence Microscopy，LSFM)已被证明是实现这种具有挑战性目标的首选技术之一。LSFM包括激发光路和探测光路两个主要的组成部分。激发光路中使用通常称为“光片”(Light Sheet，LS)的薄片状激光束作为激发光，激发片状照明区域内的荧光团。探测光路使用宽场荧光信号并行探测方式，在与片状激发光平面垂直的方向收集产生的荧光信号。通过片状激发光的快速扫描，获取待测生物样品具有高空间分辨率的三维结构荧光层析图像。LSFM这种高效的激发和探测方式，不仅有效避免了片状照明区域以外的荧光团和内源有机分子的光漂白和光损伤等问题，减少了整个样品所受到的光毒性的影响，保证了在长时间研究过程中待测活体生物样品的活力，而且有效避免了离焦荧光信号的干扰，大大提高了系统的信噪比和轴向分辨率。由于上述优点，LSFM提出后就引起了国内外科研工作者的广泛关注。国际上许多著名科研机构在LSFM方法及其应用方面开展了广泛而深入的研究工作，如：欧洲分子生物实验室E H K Stelzer课题组，美国霍华德.休斯医学研究所E Betzig课题组等。近年来，国内许多科研机构，如：北京大学陈良怡课题组和孙育杰课题组、深圳大学牛憨笨院士课题组等在LSFM方法及应用方面都开展了各具特色的研究工作，取得了丰硕的研究成果。目前，LSFM已经在发育生物学、细胞生物学、脑功能成像和神经生物学等众多研究领域中得到了广泛的应用。
[0007]使用LSFM技术获取细胞的三维结构图像时，要控制光片在探测轴方向快速移动，以实现光片对细胞层析成像。现常用手段有两种，一是快速移动光片进行扫描，二是利用微位移台来控制待测细胞纵向平移或轴向转动。这样，系统中增加光束扫描装置或微位移台，大大增加了系统的复杂程度和成本，降低了系统的可操作性和灵活性。
[0008]光镊(Optical Tweezers,OTs)技术的出现为解决上述问题提供了解决路径。OTs的核心是光与物质之间的相互作用，是利用光捕获与操控微小物体的工具。OTs技术的显著优点是它可以非接触、无损伤的方式稳定捕捉、精准操控细胞或其他大分子结构，可在液体环境中长时间的对细胞惊醒旋转、拉伸等动作。但传统的OTs系统在使用过程中会受到工作距离等诸多因素的限制，且该系统的结构复杂，价格昂贵且灵活性差。
[0009]若能将LSFM与OTs技术相结合，不仅可以大大降低LSFM系统的复杂程度和成本，也可使OTs技术的运用更加灵活。该创新利用LSFM与OTs的技术优势填补了成本及可操作性方面的缺点，为科研人员对微观领域的研究提供了极大的便利。
[0010]本专利技术提供的是一种基于五芯光纤主动光操控的数字扫描光片荧光显微成像系统。该专利技术利用五芯光纤中的四根外芯稳定捕获细胞，并精确控制细胞的旋转角度。控制细胞旋转一定角度并稳定后，五芯光纤的中间芯出射的扫描光片激发照明层面的荧光物质。光轴与照明平面垂直的显微物镜收集焦平面(照明平面)的荧光信号。收集到的荧光信号由CMOS相机记录存储，经计算机处理后得到细胞的三维图像。该专利技术实现的系统可以以非接触无损伤的方式稳定捕获和精准操控细胞，并且可以快速地获取细胞的高空间分辨率的三维结构图像，极大地缓解了荧光显微技术对活体细胞的光漂白性与光毒性问题。该系统具有灵活性高、易于操作、成本低等特点，在生物医学，生命科学等领域有光明的应用前景。

技术实现思路

[0011]本专利技术提供的是一种基于五芯光纤主动光操控的数字扫描光片荧光显微成像系统。该系统可以以非接触无损伤的方式稳定捕获和精准操控细胞，并且还可快速地获取细胞高空间分辨率的本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.本发明提供的是一种基于五芯光纤主动光操控的数字扫描光片荧光显微成像系统，其特征是：它由激光器1、19，光耦合系统2、23，分束器4、7、8，单模光纤3、5、6、12、15、16、17、24，频率调制器9、13，强度调制器10、14，时间延迟器11，耦合器18，中继光学系统20，微结构掩模板21，空间光调制器22，五芯光纤25，细胞26，细胞培养皿27，显微物镜28，取样镜29，带通滤光片30，CMOS相机31，聚光镜32，照明光源33，数据连接线34、36，计算机35组成；激光器1输出的激光光束经光耦合系统2耦合进单模光纤3，再经光纤分束器4按一定比例分成两束；其中一束连续激光经单模光纤传6输后，再由光纤分束器8分成两束，分别经光纤耦合器18耦合进五芯光纤25外围与水平面平行的两个纤芯，经纤芯传输后，在加工成特定角度锥台的光纤输出端形成聚焦光场，作为捕获细胞的捕获光；另一束连续激光经光纤分束器7分成两束，分别经光纤频率调制器9、13，和光纤强度调制器10、14进行强度调制，使用光纤时间延迟器11在两束激光脉冲之间引入可调的时间延迟Δt，两束激光脉冲经光纤耦合器18耦合进五芯光纤25外围与水平面垂直的两个纤芯，经纤芯传输后在加工成特定角度锥台的光纤输出端形成聚焦光场，分别作为推动被捕获细胞转动的推动光和停止细胞转动的制动光；五芯光纤25输出端安装在光纤夹持座上，固定在细胞培养皿27内；另一台激光器16输出的飞秒激光脉冲经中继光学系统20扩束、整形后，耦合进由微结构掩模板21和空间光调制器22构成的贝塞尔光束生成系统及全息波前预整形和优化系统，而后耦合进一条单模光纤24，再耦合进五芯光纤25的中心纤芯，在五芯光纤25输出端输出满足要求的贝塞尔光束；捕获光将细胞捕获，制动光操控细胞，贝塞尔光束形成虚拟光片，激发照明区域内的荧光团，产生的荧光信号由与虚拟光片激发光平面垂直的显微物镜28收集，通过分析CMOS相机31记录的细胞不同角度的荧光层析图像，获取活体单细胞的高空间分辨率三维结构荧光图像。2.根据权利要求1所述的光操控部分，其特征是：所述的光操控部分由固定在放置待测细胞的培养皿内且输出端加工成特定角度的五芯光纤(25)的四根外芯实现；激光器1输出的激光光束经光...

【专利技术属性】
技术研发人员：尹君，梁锐婧，于凌尧，苗琰，郑佳雯，韦耀鹏，苑立波，
申请(专利权)人：南宁桂电电子科技研究院有限公司，
类型：发明
国别省市：