一种低成本的3D细胞培养的方法技术

本发明专利技术属于生物医药技术领域，具体是指一种低成本的3D细胞培养的方法，具体方法如下，将组织块在PBS中清洗若干遍，去除死亡组织，血液，将清洗后的组织块使用手术剪刀剪成1mm3±

【技术实现步骤摘要】
一种低成本的3D细胞培养的方法


[0001]本专利技术属于生物医药
，具体是指一种低成本的3D细胞培养的方法。

技术介绍

[0002]大量研究表明干细胞尤其间充质干细胞在多种疾病的治疗、医疗美容、抗衰老、亚健康保健、药物筛选等众多领域广泛应用，然而间充质干细胞价格昂贵，如何做到低成本，高药效干细胞培养已经成为制约整个行业发展的瓶颈，因此，干细胞高质量，低成本，大规模培养及应用就成为干细胞领域研究开发的热点及难点，目前主流用于产业化的干细胞培养方法仍通过2D培养，即平面培养方式，2D培养主要通过增大培养皿面积进行，批量换液、扩散法供气，这种方式最大的缺点是产量低、耗时耗力、占空间大、培养液和人力成本巨大，而且难以标准化生产。
[0003]为此，提供一种低成本的3D细胞培养的方法。

技术实现思路

[0004]有鉴于此，本专利技术实施例希望提供一种低成本的3D细胞培养的方法，以解决或缓解现有技术中存在的技术问题，至少提供一种有益的选择。
[0005]本专利技术实施例的技术方案是这样实现的：一种低成本的3D细胞培养的方法，包括以下步骤：
[0006]步骤一、从组织中解离所需要培养的细胞；
[0007]步骤二、将细胞混在3D凝胶中，等待一个小时，待其凝固；
[0008]步骤三、在凝固的胶中加入液体培养基覆盖；
[0009]步骤四、放入培养箱中等待生长；
[0010]步骤五、观察细胞生长状态并适时添加培养基。
[0011]作为本专利技术进一步的方案：步骤一中将组织块在PBS中清洗若干遍，去除死亡组织，血液等。
[0012]作为本专利技术再进一步的方案：步骤一中将清洗后的组织块使用手术剪刀剪成0.5
±
0.5mm3的小块，在PBS中清洗若干遍。
[0013]作为本专利技术再进一步的方案：步骤一中加入适量组织解离酶，放在加热振荡器中37℃加热震荡，根据组织的性质决定震荡速度，酶类型和解离时间10
‑
30分钟。
[0014]作为本专利技术再进一步的方案：步骤一解离后加入含血清的培养基中和解离酶，离心1000
‑
2000转去上清，清洗3遍。
[0015]作为本专利技术再进一步的方案：使用PBS重悬离心后的细胞及组织碎片产物，20
‑
70um无菌滤晒过滤后的细胞悬液加入等体积的3D胶。
[0016]作为本专利技术再进一步的方案：步骤四培养箱的温度设置为37℃，所述培养箱中的二氧化碳含量设置为5％，所述培养箱中较高的相对湿度设置为95％。
[0017]作为本专利技术再进一步的方案：所述培养基包括基础的DMEM培养基、血小板裂解物
和成纤维细胞裂解物，所述血小板裂解物和成纤维细胞裂解物使用血小板，成纤维细胞反复冻融后，在0.22um过滤后冻存，使用时添加在基础培养基中。
[0018]作为本专利技术再进一步的方案：所述3D胶的主要成分为胶原蛋白、海藻酸钠和去细胞化的植物胞外基质。
[0019]作为本专利技术再进一步的方案：所述去细胞化操作包括：
[0020]步骤一、将植物按均匀厚度为0.5
±
0.3mm连续切片，切成均匀长度为每个5
±
3mm；
[0021]步骤二、物切片加入0.5
‑
0.9％ SDS溶液，以180
ꢀ‑
250RPM振荡48
‑
72小时吸去细胞。
[0022]步骤三、分别用PBS和70％乙醇洗涤三次，在PBS加1％青霉素/链霉素和1％两性霉素B孵育6小时；
[0023]步骤四、再用PBS洗涤三次后，在培养基中孵育14小时。
[0024]本专利技术实施例由于以上技术方案，其具有以下优点：
[0025]一、本方案细胞分裂快，生长旺盛，产量大，由于使用植物源的培养基，液体培养基中是裂解物不是纯化的蛋白，可以极大的降低成本，符合临床制品的生产要求。
[0026]二、本方案培养后，胶原蛋白胶及胶内细胞可以直接裂解后冻干，直接在医美或临床中使用，培养基也可以冻干使用，省去很多生产工艺。
[0027]上述概述仅仅是为了说明书的目的，并不意图以任何方式进行限制。除上述描述的示意性的方面、实施方式和特征之外，通过参考附图和以下的详细描述，本专利技术进一步的方面、实施方式和特征将会是容易明白的。
附图说明
[0028]为了更清楚地说明本申请实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本申请的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
[0029]图1为普通的海藻酸钠水凝胶培养细胞初始培育的状态图；
[0030]图2为普通的海藻酸钠水凝胶培养细胞第二天培育的状态图；
[0031]图3为植物源水凝胶培养细胞初始培育的状态图；
[0032]图4为植物源水凝胶培养细胞第四天培育的状态图；
[0033]图5为苹果切片的状态图；
[0034]图6为去细胞化苹果片培育的状态图；
[0035]图7为苹果胞外基质粉末的状态图。
具体实施方式
[0036]在下文中，仅简单地描述了某些示例性实施例。正如本领域技术人员可认识到的那样，在不脱离本专利技术的精神或范围的情况下，可通过各种不同方式修改所描述的实施例。因此，附图和描述被认为本质上是示例性的而非限制性的。
[0037]需要注意的是，术语“第一”、“第二”、“对称”、“阵列”等仅用于区分描述与位置描述目的，而不能理解为指示或暗示相对重要性或者隐含指明所指示的技术特征的数量。由
此，限定有“第一”、“对称”等特征的可以明示或者隐含地包括一个或者更多个该特征；同样，对于未以“两个”、“三只”等文字形式对某些特征进行数量限制时，应注意到该特征同样属于明示或者隐含地包括一个或者更多个特征数量；
[0038]在本专利技术中，除非另有明确的规定和限定，“安装”、“连接”、“固定”等术语应做广义理解；例如，可以是固定连接，也可以是可拆卸连接，或一体成型；可以是机械连接，可以是直接相连，可以是焊接，也可以是通过中间媒介间接相连，可以是两个元件内部的连通或两个元件的相互作用关系。对于本领域的普通技术人员而言，可以根据说明书附图结合具体情况理解上述术语在本专利技术中的具体含义。
[0039]下面结合附图对本专利技术的实施例进行详细说明。
[0040]本专利技术一种低成本的3D细胞培养的方法，包括以下步骤：
[0041]步骤一、从组织中解离所需要培养的细胞；
[0042]步骤二、将细胞混在3D胶中，等待1
‑
2个小时，待其凝固；
[0043]步骤三、在凝固的胶中加入液体培养基覆盖；
[0044]步骤四、放入培养箱中等待生长；
[0045]步骤五、观察本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种低成本的3D细胞培养的方法，其特征在于，包括以下步骤：步骤一、从组织中解离所需要培养的细胞；步骤二、将细胞混在预制的3D胶中，等待1
‑
2个小时，待其凝固；步骤三、在凝固的胶中加入含血小板裂解物及成纤维细胞裂解物的液体培养基覆盖；步骤四、放入培养箱中等待生长；步骤五、观察细胞生长状态并适时添加培养基；本使用方法应用于组织工程等领域。2.根据权利要求1所述的一种低成本的3D细胞培养的方法，其特征在于：步骤一中将组织块在PBS中清洗若干遍，去除死亡组织，血液等。3.根据权利要求2所述的一种低成本的3D细胞培养的方法，其特征在于：步骤一中将清洗后的组织块使用手术剪刀剪成0.5
±
0.5mm3的小块，在PBS中清洗若干遍。4.根据权利要求3所述的一种低成本的3D细胞培养的方法，其特征在于：步骤一中加入适量组织解离酶，放在加热振荡器中37℃加热震荡，使用DNA解离酶，胶原蛋白酶，分散酶，胰蛋白酶类、中性蛋白酶、弹性蛋白酶，中的一种或几种进行解离，解离时间10
‑
30分钟。5.根据权利要求4所述的一种低成本的3D细胞培养的方法，其特征在于：步骤一解离后加入含血清的培养基中和解离酶，离心1000
‑
2000转去上清，清洗3遍。6.根据权利要求5所述的一种低成本的3D细胞培养的方法，其特征在于：使用PBS重悬离心后的细胞及组织碎片产物，20
‑
70um无菌滤晒过滤后的细胞悬液加入一定量的3D胶。7.根据权利要求6所述的一种低成本的3D细胞培养的方法，其特征在于：步骤...

【专利技术属性】
技术研发人员：刁明昆，
申请(专利权)人：深圳市兰韵生物创能科技有限公司，
类型：发明
国别省市：