一种识别外泌体的融合蛋白及其应用制造技术

本发明专利技术属于外泌体富集技术领域，公开了一种识别外泌体的融合蛋白及其应用。本发明专利技术提供一种识别外泌体的融合蛋白，包括支架蛋白和外泌体结合肽；所述支架蛋白包括hBD3蛋白和/或Syntynin

【技术实现步骤摘要】
一种识别外泌体的融合蛋白及其应用


[0001]本专利技术涉及外泌体富集
，具体涉及一种识别外泌体的融合蛋白及其应用。

技术介绍

[0002]外泌体为细胞分泌到胞外的纳米囊泡，其粒径约为30nm~160nm。外泌体具有双层膜结构，电镜下呈现茶托状形态。外泌体含有蛋白、核酸及脂质等，可被细胞摄取进入胞内，参与细胞间的分子传递及通讯。外泌体广泛参与了细胞物质信息运输，调控细胞生理功能，能够进行抗原呈递、促进肿瘤发生转移等。不同细胞分泌的外泌体在数量和内含物差异性大，外泌体膜蛋白CD9、CD63、CD81及内部蛋白TSG101、HSP90作为其通用标记，后续发现膜蛋白CD47、SLC1A5、SLC3A2、ITGB1等也在外泌体普遍存在。不同来源外泌体特异性内含物可以作为其来源细胞的标记，作为疾病早期诊断标记物，目前已有报道通过外泌体分析获得对相应肿瘤的预测。此外，通过工程化改造外泌体，或电转化、化学点击等方法搭载药物分子，用于疾病的治疗。
[0003]外泌体分离富集是外泌体用于诊断及应用的重要前提。超速离心是外泌体分离的金标准。随着研究深入，多种方法被应用于外泌体分离富集，包括切向流离心、密度梯度离心、排阻柱层析、微流控芯捕获等方法。然而，这些方法需要价格昂贵精密仪器，在仪器购买、空间和操作层面有诸多限制，且富集效果差。现有技术公开了利用蛋白或肽识别外泌体并进行富集的方法。利用外泌体膜蛋白抗体，结合Protein A/G beads，或固定外泌体膜蛋白抗体beads，进行免疫亲和富集外泌体。然而，该方法中抗体生产成本高，是限制该方法普及的重要因素。此外，还可以利用外泌体质膜识别肽，或外泌体膜蛋白特异性结合肽（如特异性识别外泌体膜蛋白CD63蛋白的肽段CP05）固定化beads，亲和捕获外泌体。然而，该方法中肽段依赖体外合成，其所需技术高且成本高，限制该方法的广泛应用。

技术实现思路

[0004]本专利技术的目的在于克服现有技术的不足之处而提供一种识别外泌体的融合蛋白及其应用。
[0005]为实现上述目的，本专利技术采取的技术方案如下：第一方面，本专利技术提供一种识别外泌体的融合蛋白，包括支架蛋白和外泌体结合肽；所述支架蛋白包括hBD3蛋白和/或Syntynin
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1蛋白N端；所述hBD3蛋白和所述Syntynin
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1蛋白N端由linker序列连接；在所述支架蛋白的N末端、内部或C末端融合表达所述外泌体结合肽。
[0006]本专利技术的融合蛋白能够识别外泌体膜蛋白多个膜蛋白，相比脂质结合肽、膜蛋白抗体、膜蛋白结合肽等单个成分或蛋白识别具有优势。所述融合蛋白可单独使用hBD3、Syntynin
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1蛋白N端作为支架蛋白，在支架蛋白N末端、C末端或内部融合表达其他外泌体结合肽，所述外泌体结合肽与hBD3、Syntynin
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1蛋白N端可以不同数量及不同排序来组合。
[0007]作为本专利技术所述的识别外泌体的融合蛋白的优选实施方式，所述外泌体结合肽包括ITGB1结合肽RGD4C、CD63结合肽CP05。
[0008]作为本专利技术所述的识别外泌体的融合蛋白的优选实施方式，所述linker序列选自3GS linker、G4S linker、EA3K linker中的至少一种。
[0009]作为本专利技术所述的识别外泌体的融合蛋白的优选实施方式，所述融合蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示。
[0010]作为本专利技术所述的识别外泌体的融合蛋白的优选实施方式，所述融合蛋白还包括蛋白分离标签；所述蛋白分离标签选自His、Strep Tag II、GST、MBP中的至少一种。
[0011]第二方面，本专利技术提供一种编码识别外泌体的融合蛋白的核苷酸，所述核苷酸的碱基序列如SEQ ID NO:2所示。
[0012]第三方面，本专利技术提供一种重组菌，所述重组菌表达上述的融合蛋白。
[0013]作为本专利技术所述的重组菌的优选实施方式，所述重组菌为大肠杆菌。
[0014]第四方面，本专利技术提供一种细胞外泌体的富集方法，包括以下步骤：（1）诱导所述重组菌表达所述融合蛋白，分离所述融合蛋白；（2）纯化并变性所述融合蛋白，得变性蛋白；（3）加入磁珠固化所述变性蛋白；复性所述变性蛋白，得复性磁性粒子；（4）收集细胞外泌体；将所述复性磁性粒子与所述细胞外泌体共孵育，通过磁性分离富集外泌体。
[0015]作为本专利技术所述的富集方法的优选实施方式，在所述步骤（2）中，所述变性采用7 M~9 M尿素或5 M~7 M盐酸胍处理；在所述步骤（3）中，所述复性采用大量稀释复性法、透析、超滤溶液置换法中的至少一种；在所述步骤（4）中，所述收集细胞外泌体采用超速离心、切向流离心、SEC、超滤、密度梯度离心中的至少一种；所述细胞外泌体来自组织体液、原代细胞培养液、细胞系培养液中的至少一种。
[0016]与现有技术相比，本专利技术的有益效果为：本专利技术设计了识别外泌体普遍表达膜蛋白的融合蛋白，该融合蛋白能够识别外泌体膜蛋白多个膜蛋白，相比脂质结合肽、膜蛋白抗体、膜蛋白结合肽等单个成分或蛋白识别具有优势。该融合蛋白使用大肠杆菌表达及标签纯化，无需像多肽人工合成，或纯化抗体等高成本复杂操作。在变性条件下该融合蛋白能与链霉亲和素磁珠能够高效组装，抵抗不同溶液条件能力强。该融合蛋白磁珠可通过多次点加至大体系复性溶液中，完成蛋白复性，且复性后蛋白能够在磁珠上稳定保持不脱落并保持活性，与透析、超滤置换溶液等措施便捷且复性效率高。本专利技术通过大量表达制备能够识别外泌体的融合蛋白，并将其固定于磁性粒子表面，利用其识别外泌体及磁性分离特性，便捷经济收集外泌体，进行后续研究或应用。
附图说明
[0017]图1为外泌体捕获磁珠ExoBPmagbeads构建及外泌体磁分离示意图；图2为pET28a
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His
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Strep Tag II
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ExoBP表达质粒示意图；图3为His
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Strep Tag II
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ExoBP融合蛋白示意图；图4为His
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Strep Tag II
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ExoBP诱导表达检测；
图5为His
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Strep Tag II
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ExoBPWB验证；图6为变性条件下Ni琼脂糖纯化的His
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Strep Tag II
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ExoBP检测；图7为变性条件下链霉亲和素磁珠（Samagbeads）结合His
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Strep Tag II
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ExoBP后形成ExoBPmagbeads的检测；图8为ExoBPmagbeads通过稀释（dil）和透析（dia）复性后的检测；图9为脐带间充质干细胞无血清培养液超速离心后SEC HPLC检测；图10为脐带间充质干细胞外泌体通过ExoBPmagbeads分离后外泌体marker检测；图11本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种识别外泌体的融合蛋白，其特征在于，包括支架蛋白和外泌体结合肽；所述支架蛋白包括hBD3蛋白和/或Syntynin
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1蛋白N端；所述hBD3蛋白和所述Syntynin
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1蛋白N端由linker序列连接；在所述支架蛋白的N末端、内部或C末端融合表达所述外泌体结合肽。2.根据权利要求1所述的识别外泌体的融合蛋白，其特征在于，所述外泌体结合肽包括ITGB1结合肽RGD4C、CD63结合肽CP05。3.根据权利要求1或2所述的识别外泌体的融合蛋白，其特征在于，所述linker序列选自3(GS)linker、G4S linker、EA3K linker中的至少一种。4.根据权利要求1所述的识别外泌体的融合蛋白，其特征在于，所述融合蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示。5.根据权利要求1所述的识别外泌体的融合蛋白，其特征在于，所述融合蛋白还包括蛋白分离标签；所述蛋白分离标签选自His、Strep Tag II、GST、MBP中的至少一种。6.一种编码识别外泌体的融...

【专利技术属性】
技术研发人员：秦大江，王旭，陈清，王霞，凌奕霞，
申请(专利权)人：广州医科大学附属第五医院广州再生医学与健康广东省实验室附属医院，
类型：发明
国别省市：