一种鉴别不同结缕草种质亲缘关系的引物及应用制造技术

本发明专利技术公开了一种鉴别不同结缕草种质亲缘关系的引物，属于结缕草种质亲缘关系鉴定技术领域，引物序列如SEQ ID NO.11～SEQ ID NO.12所示，将该引物用于制备试剂盒，可以特定对结缕草的亲缘关系进行鉴定。对结缕草的亲缘关系进行鉴定。对结缕草的亲缘关系进行鉴定。

【技术实现步骤摘要】
一种鉴别不同结缕草种质亲缘关系的引物及应用


[0001]本专利技术涉及结缕草种质亲缘关系鉴别
，更具体地说是涉及一种鉴别不同结缕草种质亲缘关系的引物及应用。

技术介绍

[0002]结缕草属(Zoysia Willd.)隶属于禾本科多年生低矮草本植物，一般分为11个种，多个变种以及变型，其中大多数结缕草可用于运动场草坪、休憩草坪及保土草坪等的建植。结缕草属植物在我国分布有5个种，2个变种和1个变型。5个种分别是结缕草(Z.japonica Steud.)、细叶结缕草(Z.tenuiflia willd.exTrin.)、沟叶结缕草(Z.matrella(L.)Merr.)、大穗结缕草(Z.macorostachya Franch.etSva.)以及中华结缕草(Z.sinicaHance)；2个变种分别是青结缕草(Z.japon ica var.pollida Nakai et Honda)和长花结缕草(Z.sinica var.nipponica Ohwi.)；1个变型是大穗日本结缕草(Z.japonica f.macrostachya H.D.Dung et L.J.Gong)。其中结缕草是该属中分布范围最广、应用面积最大的一个种，也是中国结缕草属的代表种。
[0003]近年来，分子标记技术在草坪草种质资源的研究中的应用越来越广泛。在结缕草属植物的研究中也有广泛的应用。EST
‑
SSR(Expressed Sequence Tag
‑
Simple sequence repeat)是基于表达序列标签开发微卫星的一种分子标记，与基因组SSR标记相比具有更高的转译能力。由于EST
‑
SSR标记是一类功能标记，是以推测出EST序列功能为基础获得的。目前，EST
‑
SSR被广泛应用于植物基因组学研究，遗传图谱的构建、比较作图、遗传多样性的评价等方面。很少应用于结缕草属种质资源的研究。
[0004]因此，如何将EST
‑
SSR应用于结缕草的分子标记中，并开发鉴定不同结缕草种质亲缘关系的引物是本领域技术人员亟需解决的技术问题。

技术实现思路

[0005]有鉴于此，基于EST
‑
SSR分子标记的诸多优越性，本专利技术采用EST
‑
SSR分子标记的方法对不同地理来源的结缕草属种质进行遗传变异研究，从分子水平上探讨了结缕草种质资源的遗传多样性，为结缕草属种质资源的研究奠定了良好的基础。
[0006]为了实现上述目的，本专利技术采用如下技术方案：
[0007]一种鉴别不同结缕草种质亲缘关系的引物，所述引物序列如SEQ ID NO.11～SEQ ID NO.12所示；
[0008]上游引物F：5
’‑
TGCTCAAACTTGCTTTCCTG
‑3’
，如SEQ ID NO.11所示；
[0009]下游引物R：5
’‑
CCGTGCAATCGTAGTACCAG
‑3’
，如SEQ ID NO.12所示。
[0010]优选地，所述引物序列还包括：SEQ ID NO.1～SEQ ID NO.10和SEQ ID NO.13～SEQ ID NO.40所述的引物中的任意两组引物。
[0011]作为与上述技术方案相同的专利技术构思，本专利技术还请求保护所述的引物在制备鉴别不同种质结缕草亲缘关系的试剂盒中的应用。
[0012]作为与上述技术方案相同的专利技术构思，本专利技术还请求保护一种鉴别不同结缕草种质亲缘关系的试剂盒，包括SEQ ID NO.1～SEQ ID NO.40所示引物中任意一组或三组的结合；具体为：
[0013][0014]作为与上述技术方案相同的专利技术构思，本专利技术还请求保护一种鉴别不同种质结缕草亲缘关系的方法，以所述试剂盒进行检测。
[0015]作为与上述技术方案相同的专利技术构思，本专利技术还请求保护一种鉴别不同结缕草种质亲缘关系的方法，过程包括：
[0016]1)利用筛选出的20对EST
‑
SSR引物中的任意3对引物对43份结缕草属种质进行EST
‑
SSR的PCR扩增，得到多态性条带，并观察每对引物扩增出的等位基因数量；
[0017]2)根据EST
‑
SSR引物的多态性条带，利用NTSYS软件对43份结缕草属种质进行遗传多样性研究，确定遗传系数，分析亲缘关系的远近。
[0018]经由上述的技术方案可知，与现有技术相比，本专利技术公开提供了一种鉴别不同种质结缕草亲缘关系的引物，该引物可以对不同种质结缕草间的亲缘关系进行鉴定，为后续研究结缕草的遗传性能奠定了基础。
附图说明
[0019]为了更清楚地说明本专利技术实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本专利技术的实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据提供的附图获得其他的附图。
[0020]图1附图为EST
‑
SSR分析的43份结缕草属UPGMA聚类图。
具体实施方式
[0021]下面将结合本专利技术实施例中的附图，对本专利技术实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本专利技术一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本专利技术中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本专利技术保护的范围。
[0022]实施例1引物筛选
[0023]1)DNA的提取与验证
[0024]采用改良CTAB法提取43份结缕草属种质的DNA，将提取的DNA用1％的琼脂糖凝胶电泳检测提取的纯度和质量，利用核酸蛋白仪测定DNA浓度和OD值，将DNA稀释到约50ng/μ
L，最后放入
‑
20℃冰箱中保存备用。
[0025]2)引物的筛选
[0026]选取EST
‑
SSR引物共125对(表5)。选择来源不同的6份结缕草种质(4号、9号、31号、37号、40号、42号)，对125对引物进行筛选，最终筛选出了20对条带清晰、多态性好、主带明显的EST
‑
SSR标记，引物序列见表1；
[0027]表1
[0028][0029][0030]3)PCR扩增和电泳检测
[0031]PCR反应体系见表2。扩增过程在PCR仪上进行，扩增程序为：94℃预变性5min；94℃变性30s，55℃退火45s，72℃延伸1min，循环35次；最后72℃延伸5min，4℃保存，PCR扩增产物用8％聚丙烯酰胺凝胶电泳检测，电泳完成后，利用AgNO3染色、NaOH和甲醛显色，最后拍照记录。
[0032]表2 PCR扩增反应体系
[0033][0034]结果为：利用筛选出来的20对EST
‑...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种鉴别不同结缕草种质亲缘关系的引物，其特征在于，所述引物序列如SEQ ID NO.11～SEQ ID NO.12所示；上游引物F：5
’‑
TGCTCAAACTTGCTTTCCTG
‑3’
，如SEQ ID NO.11所示；下游引物R：5
’‑
CCGTGCAATCGTAGTACCAG
‑3’
，如SEQ ID NO.12所示。2.根据权利要求1所述的一种鉴别不同结缕草种质亲缘关系的引物，其特征在于，所述引物序列还包括：SEQ ID NO.1～SEQ ID NO.10和SEQ ID NO.13～SEQ ID NO.40所述的引物中的任意两组引物。3.权利要求1或2所述的引物在制备鉴别不同结缕草种质亲缘关系...

【专利技术属性】
技术研发人员：黄春琼，董荣书，何潇，刘攀道，严琳玲，刘国道，
申请(专利权)人：中国热带农业科学院热带作物品种资源研究所，
类型：发明
国别省市：