用于肽生产的组合物和方法技术

本公开内容涉及通过包含特异性蛋白酶识别位点或化学裂解序列的重组多肽的蛋白水解产生具有靶氨基酸序列的产物肽。在一些实施方案中，产物肽通过蛋白水解去除中间氨基酸序列从重组多肽中的重复肽单元释放，所述蛋白水解是通过识别中间氨基酸序列内位点的蛋白酶，以及羧肽酶、氨肽酶和/或其他蛋白酶。氨肽酶和/或其他蛋白酶。氨肽酶和/或其他蛋白酶。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】用于肽生产的组合物和方法
[0001]公开内容的领域
[0002]本公开内容总体上涉及用于改进重组多肽产生的系统、组合物和方法。在特定实施方案中，包含编码包含多于一个连接肽的多肽的开放阅读框的构建体可用于简化或减少产生纯化肽所需的步骤数量，和/或增加纯化肽产物的产量。因此，本专利技术涉及包含上述构建体的核酸分子、包含所述核酸分子的细胞、包含所述核酸分子和/或细胞的系统和生产设备，以及包含和/或使用任何和所有前述内容的重组肽生产方法。
[0003]背景
[0004]纯化肽在许多应用中是有用的；例如，在诊断应用中，作为治疗剂，作为食物成分/添加剂，以及作为病原体抑制剂。短和中等大小的肽通常通过化学合成方法产生。然而，这些方法仅对于最短的肽是最经济的，并且翻译后修饰在化学合成期间不容易实现。此外，化学合成需要使用极其危险的化学品。
[0005]重组DNA技术为化学合成提供了次优的替代品，尽管在某些情况下它是优选的。重组方法使用细胞的内源性蛋白质产生机构来生产异源肽。重组肽合成需要许多复杂的生化过程，包括转录、翻译、蛋白质折叠和翻译后修饰(例如，糖基化和二硫键形成)，这些过程通常由酶催化。使用这些内源性过程生产重组肽的技术仍然具有挑战性，例如，由于它们在不同细胞中对相同前体多肽的不同操作。
[0006]此外，常规重组肽生产可获得的产率不足够高以与化学合成方法竞争大多数中等大小肽的合成。生产含有期望肽的串联重复序列的多肽是设计为解决这些问题的一种策略，尤其是为了提高产量。然而，使用化学物质或蛋白酶将肽从翻译的多肽上裂解下来的现有裂解策略在最终的肽产物中留下了额外的氨基酸。这些额外的氨基酸具有许多显著的缺点，这些缺点阻碍了肽的预期用途；例如，额外的氨基酸可能通过引发免疫原性响应而为医学应用带来问题，并且额外的氨基酸还可能干扰肽的生理功能。因此，需要昂贵的临床试验来验证它们在医学应用中的用途，即使不含额外氨基酸的肽的使用已经被批准。
[0007]使用串联重复序列增加肽生产产量的另外的障碍是嵌合蛋白必须被设计成使得裂解位点都可被裂解剂接近，否则将无法实现肽产量的预期增加。
[0008]已经提出了几种解决方案来解决达到重组肽生产技术的全部前景的一些前述障碍，但是没有一种解决方案足以提供通常可用于以高产量、成本有效且环境友好的方式、独立于肽长度且不形成包涵体地产生基本上所有具有精确预期序列的期望肽的生产平台。
[0009]美国专利第6,051,399号描述了通过在接头肽的氨基末端引入异源半胱氨酸和在羧基末端引入甲硫氨酸，从串联重复序列生产重组C
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末端酰胺化肽的方法。这要求得到的肽不含游离半胱氨酸或甲硫氨酸。当这些氨基酸中的任何一种存在于期望的肽中时，不可能产生肽的精确序列。例如，当接头序列的C
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末端以半胱氨酸结束时，肽的N
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末端在裂解反应期间被亚氨基噻唑烷
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羧基基团修饰。或者，当接头肽以甲硫氨酸开始时，则高丝氨酸内酯被引入肽中。这些修饰干扰了肽的许多应用，并且因此这些方法不适合可适用于任何肽生产的一般生产系统。此外，串联重复序列的设计应使得裂解序列易于被化学剂和蛋白酶接近。否则，需要串联重复序列的变性以暴露裂解位点。这可能是有问题的，特别是对于串
联重复序列的酶促裂解，因为酶本身在存在变性剂的情况下变性。
[0010]公开内容的概述
[0011]本公开内容描述了以增加产量的另外益处生产具有精确预期靶序列的重组产物肽的问题的解决方案，并且通过采用环境友好的试剂和方法以及通过消除方法步骤来限制所需的资源。因此，本公开内容提供了包含连接肽的构建体、系统和多肽，其在实施方案中用于有效地产生适用于许多应用(从营养到人类或动物的医疗和药物用途)的广泛的产物肽。
[0012]在实施方案中，酶催化的蛋白水解单独使用或与化学蛋白水解组合使用，以将包含多于一个肽重复序列的重组多肽裂解成由期望的靶氨基酸序列组成的产物肽。在特定的实施方案中，重组多肽可溶于水性环境；例如细胞(例如，细菌细胞诸如大肠杆菌(E.coli))的胞质溶胶。因此，本文的实施方案包括本文描述的含肽重复序列的多肽、编码这样的多肽的核酸、包含这样的构建体和/或多肽的宿主细胞和重组生产平台，以及使用前述生产由靶氨基酸序列组成的产物肽的方法。
[0013]因此，一些实施方案包括重组多肽(例如，翻译产物多肽)，其包含多于一个具有靶序列的产物肽，还包含每个产物肽之间的至少一个中间“接头序列”，其中接头序列包含第一蛋白水解反应中蛋白酶的裂解位点，以产生中间肽，该中间肽随后被酶促或化学加工成由靶序列组成的产物肽。实例包括，其中产物肽具有相同的靶氨基酸序列的多肽，其中多肽包含两个具有不同靶氨基酸序列的产物肽的实例，以及其中多肽包含多于两个具有不同靶氨基酸序列的产物肽的实例。
[0014]在特定方面，多于一个中间肽和中间接头序列包含至少一个包含识别两或四个连续的碱性氨基酸的蛋白酶裂解位点(P.C.S.)的接头序列(例如，多于一个或所有接头序列)。用这样的蛋白酶蛋白水解多肽产生中间肽，所述中间肽包含产物肽的靶氨基酸序列羧基末端的碱性氨基酸。在本文的实例中，羧肽酶对中间肽的蛋白水解消除了剩余的额外碱性残基，产生由靶氨基酸序列组成的产物肽。
[0015]在特定方面，在接头序列中使用小氨基酸，尤其是甘氨酸，结合使用识别大量带电氨基酸的蛋白酶，可以确保裂解位点暴露于裂解试剂。
[0016]在特定方面，多于一个中间肽和中间接头序列包括至少一个接头序列(例如，多于一个或所有接头序列)，所述接头序列包含氨基末端化学裂解序列(C.C.S.)和在P1
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位置不留下无关(extraneous)氨基酸的蛋白酶裂解位点。在本文的实例中，用这样的蛋白酶蛋白水解多肽产生包含氨基末端C.C.S.的中间肽。在本文的实例中，中间肽的化学蛋白水解产生由靶氨基酸序列组成的产物肽。
[0017]在一些实施方案中，用一种或更多种逆转录病毒蛋白酶蛋白水解多肽可以单独使用或与一种或更多种另外蛋白酶组合使用。被逆转录病毒蛋白酶蛋白水解可以发生在分别在P1和P1
’
位置处具有芳香族残基和脯氨酸的1型裂解位点，或者在P1位置处具有疏水残基的2型裂解位点。依赖于固着键(sessile bond)的C
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末端侧进行底物识别的逆转录病毒蛋白酶可以与在P1
’
位置处不留下氨基酸的其他蛋白酶组合用于多肽。
[0018]在实例中，重组多肽还包含至少一个肽单元，其不形成中间肽产物或接头序列的一部分；例如，在多肽的N
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末端，或在多肽的C
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末端。在某些实施方案中，多肽可以在多肽的N
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末端和C
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末端都包含这样的肽单元。这样的肽单元的非限制性实例包括改善检测、纯化
和/或增溶的标签；N
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末端或C
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末端加帽单元；受体；信号结构域；和靶本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】1.一种重组多肽，包含：a)多于一个肽单元；b)每个所述肽单元包含第一蛋白酶识别序列、裂解序列和由靶氨基酸序列组成的产物肽；并且c)选择所述第一蛋白酶识别序列和所述裂解序列，使得所述第一蛋白酶识别序列和所述裂解序列的裂解都不产生与所述靶氨基酸序列无关的氨基酸残基。2.根据权利要求1所述的重组多肽，其中所述第一蛋白酶识别序列包括SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:30。3.根据权利要求1所述的重组多肽，其中所述第二裂解序列是包含SEQ ID NO:46
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56的化学裂解序列。4.根据权利要求1所述的重组多肽，其中所述裂解序列是第二蛋白酶识别序列。5.根据权利要求4所述的重组多肽，其中所述第二蛋白酶识别序列选自由SEQ ID NO:175和SEQ ID NO:200组成的组。6.根据权利要求1所述的重组多肽，其中接头序列位于所述第一蛋白酶识别序列和所述裂解序列之间。7.根据权利要求6所述的重组多肽，其中所述接头序列选自由以下组成的组：Gly、Ala、Ser和SEQ ID NO:57
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83。8.根据权利要求1所述的重组多肽，其中所述第二裂解序列位于每个所述肽单元的N
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末端，并且所述产物肽位于每个所述肽单元的C
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末端。9.根据权利要求1所述的重组多肽，其中所述多于一个肽单元包含第一肽单元和第二肽单元，并且所述第一肽单元具有至少一个与所述第二肽单元不同的氨基酸。10.根据权利要求9所述的重组多肽，其中所述第一肽单元具有不同于所述第二肽单元的第二靶氨基酸序列的第一靶氨基酸序列。11.一种重组多肽，包含：a)多于一个肽单元；b)每个所述肽单元包含第一蛋白酶识别序列、裂解序列、接头序列和由靶氨基酸序列组成的产物肽；c)所述裂解序列是化学裂解序列或第二蛋白酶识别序列；并且e)所述接头序列位于所述第一蛋白酶识别序列和所述第二裂解序列之间。12.根据权利要求11所述的重组多肽，其中所述接头序列选自由以下组成的组：Gly、Ala、Ser和SEQ ID NO:57
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83。13.根据权利要求12所述的重组多肽，其中所述接头序列包含小氨基酸，并且其中所述接头序列、所述第一蛋白酶识别序列和所述裂解序列共同具有至少一个带电残基和一个极性残基。14.根据权利要求11所述的重组多肽，其中所述裂解序列形...

【专利技术属性】
技术研发人员：贾姆希德，
申请(专利权)人：生物催化剂有限责任公司，
类型：发明
国别省市：