一种用于流感病毒裂解疫苗的裂解方法技术

本申请涉及一种用于流感病毒裂解疫苗的裂解方法。通过优化裂解时间、裂解剂浓度、反应温度、蛋白浓度，改善了病毒颗粒的裂解效果。本申请的疫苗裂解方法适用于多价流感病毒裂解疫苗的生产，所制备的疫苗具有较好的安全性和免疫原性，且批间质量一致。且批间质量一致。

【技术实现步骤摘要】
一种用于流感病毒裂解疫苗的裂解方法


[0001]本申请涉及医药领域。更具体地，涉及一种用于流感病毒裂解疫苗的裂解方法。

技术介绍

[0002]流行性感冒是分别由甲、乙、丙三型流感病毒引起的一种急性呼吸道疾病。流感病毒常为球形囊膜病毒，直径80至120nm。病毒的毒粒结构分为三层，最外层为双层类脂囊膜，它来自病毒复制的宿主细胞。囊膜散布着形态不一的蛋白突起，一种能凝集红细胞的称血凝素(H或HA)；另一种为神经氨酸酶(N或NA)；最后一种蛋白突起为M2。三种突起均插入内脂膜，并以疏水性氨基酸为锚固定在类脂膜，可能与M1蛋白膜相接触。中间层为类脂膜下面的基质(M1)蛋白形成的球形蛋白。里层为核壳体，呈螺旋对称，直径9至15nm，它含核蛋白(NP)。
[0003]血凝素为流感病毒表面的一种糖蛋白，在病毒感染宿主细胞过程中发挥关键作用。HA蛋白可被分为两个结构域：远离病毒外膜的球状结构域和靠近外膜的茎状结构域；头部球状结构域含有受体结合位点和主要抗原区，极易发生变异引起病毒抗原性和宿主嗜性的改变，茎部区域相对比较保守，对HA三聚体的稳定性和锚定在细胞膜上至关重要。HA裂解为HA1和HA2是病毒感染宿主细胞的先决条件。HA1蛋白结合细胞表面唾液酸受体介导病毒进入宿主细胞，随后细胞内体中的低pH环境会触发HA2蛋白发生不可逆的构象变化，促使病毒囊膜和细胞膜发生融合，从而使病毒基因组释放到宿主细胞质中引发感染。HA蛋白能刺激宿主产生中和抗体，是流感病毒的主要保护性抗原，也是流感疫苗的靶标蛋白。
[0004]迄今，流感疫苗主要分为全病毒疫苗、裂解疫苗和亚单位疫苗。裂解疫苗因具有较好的免疫原性和安全性，成为主要上市产品。在裂解疫苗的生产工艺中，需要加入合适浓度的裂解剂对病毒进行裂解处理。国内外常用的裂解剂有吐温80、十六烷基三甲基溴化铵、曲拉通Triton N
‑
101、聚乙二醇辛基苯基醚、曲拉通Triton X
‑
100、乙醚、乙醚+吐温80等。其中，较常用的的是曲拉通Triton X
‑
100。研究表明，在流感病毒裂解过程中，裂解剂浓度、病毒蛋白质含量及裂解时间对流感病毒裂解效果均有显著影响。
[0005]因此，本领域仍需要提供一种改进的裂解方法和工艺，以确保疫苗的安全性和有效性。

技术实现思路

[0006]鉴于上述需求，提供了一种用于流感病毒裂解疫苗的裂解方法，其包括步骤：
[0007]1)提供包含流感病毒的介质；
[0008]2)在10至30℃，使包含流感病毒的介质和Triton X
‑
100接触不少于1小时；
[0009]3)收获裂解的流感病毒。
[0010]在一些实施方案中，流感病毒选自以下任一种或其组合：H1N1或其变体、H3N2或其变体、B/Victoria系或其变体、B/Yamagata系或其变体。
[0011]在一些实施方案中，Triton X
‑
100的终浓度不低于4500μg/ml且不高于5500μg/
ml；优选5000μg/ml。
[0012]在一些实施方案中，包含流感病毒的介质中总蛋白含量不低于500μg/ml，优选500μg/ml至3000μg/ml。
[0013]在一些实施方案中，包含流感病毒的介质和Triton X
‑
100接触至少1小时，优选1至3小时。
[0014]在一些实施方案中，裂解的流感病毒中：
[0015]粒径在10nm至13nm的病毒颗粒占95％至98％；
[0016]粒径在150nm至180nm的病毒颗粒不超过5％。
[0017]在一些实施方案中，包含流感病毒的介质获自鸡胚培养法中梯度密度离心的收集物。在具体的实施方案中，包含流感病毒的介质获自糖度为35％至50％的收集物。
[0018]在一些实施方案中，本申请的裂解方法还包括去除Triton X
‑
100的步骤。
[0019]在一些具体的实施方案中，本申请的裂解方法包括步骤：
[0020]1)提供包含流感病毒的介质，其是鸡胚培养法中糖度为35％至50％的梯度密度离心收集物；
[0021]2)向包含流感病毒的介质中加入终浓度为5000μg/ml
±
500μg/ml的Triton X
‑
100，在10至30℃，搅拌至少1小时，不超过3小时；
[0022]3)在不低于8000g时，离心收集上清液；
[0023]4)使上清液通过截留分子量为50kD的过滤器，用0.01M PBS缓冲液冲洗以去除Triton X
‑
100；
[0024]5)获得裂解的流感病毒。
[0025]本申请还提供了一种生产四价流感病毒疫苗的方法，其包括本申请的裂解方法。
[0026]在一些实施方案中，生产四价流感病毒疫苗的方法包括步骤：
[0027]i)向9至11日龄的鸡胚接种选自以下的任一种：H1N1或其变体、H3N2或其变体、B/Victoria系或其变体、B/Yamagata系或其变体，得到接种的鸡胚；
[0028]ii)在温度34
±
1℃，湿度60％
±
10％时，将接种的鸡胚培养48至72小时；
[0029]iii)在2至8℃时，冷胚8至96小时；
[0030]iv)从鸡胚中提取尿囊液；任选地，向尿囊液加入终浓度30mmol/L
±
10％的柠檬酸钠缓冲液和含0.01％v/v
±
10％表面活性剂的缓冲液；
[0031]v)通过选自以下的任一项对步骤iv)所得尿囊液进行粗提，以得到粗提物：离心(优选地，在大于10000g的离心力下进行离心)、超滤(优选地，通过截留分子量为300kD的过滤器进行超滤)、冲洗(优选地，通过磷酸盐缓冲液进行冲洗)、或其组合；
[0032]vi)对粗提物进行梯度密度离心，蔗糖梯度为28％至50％(优选35％至50％)，获得梯度密度离心的收集物；
[0033]vii)对所述收集物进行本申请的裂解方法；
[0034]viii)灭活裂解的流感病毒，得到灭活的单价病毒液。
[0035]在一些实施方案中，生产四价流感病毒疫苗的方法还包括以下步骤：
[0036]ix)灭活的单价病毒液通过截留分子量为100kD的过滤器，用0.01M PBS缓冲液冲洗，除菌，得到单价原液；
[0037]x)混合不同的单价原液；
[0038]xi)任选地，进行稀释和/或分装，得到流感病毒疫苗。
[0039]在一些实施方案中，经0.2μm滤膜进行所述除菌。
[0040]在一些实施方案中，根据(同一种)血凝素的含量，混合不同的单价原液。
附图说明
[0041]图1：H1N1型病毒裂解0.5h时的透射电镜图。
[0042]图2：本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种用于流感病毒裂解疫苗的裂解方法，其包括步骤：1)提供包含流感病毒的介质；2)在10至30℃，使包含流感病毒的介质和Triton X
‑
100接触不少于1小时；3)收获裂解的流感病毒；其中，所述流感病毒选自以下任一种或其组合：H1N1或其变体、H3N2或其变体、B/Victoria系或其变体、B/Yamagata系或其变体；所述Triton X
‑
100的终浓度不低于4500μg/ml且不高于5500μg/ml；优选5000μg/ml；所述包含流感病毒的介质中总蛋白含量不低于500μg/ml，优选500μg/ml至3000μg/ml；优选地，所述接触为至少1小时；优选地，所述裂解方法对H1N1或其变体、H3N2或其变体、B/Victoria系或其变体、B/Yamagata系或其变体是兼容的。2.根据权利要求1所述的方法，所述裂解的流感病毒中：粒径在10nm至13nm的病毒颗粒占95％至98％；粒径在150nm至180nm的病毒颗粒不超过5％。3.根据权利要求1或2所述的方法，所述包含流感病毒的介质获自鸡胚培养法中梯度密度离心的收集物；优选糖度为35％至50％的收集物。4.根据权利要求1至3中任一项所述的方法，还包括去除Triton X
‑
100的步骤。5.根据权利要求1至4中任一项所述的方法，包括步骤：1)提供包含流感病毒的介质，其是鸡胚培养法中糖度为35％至50％的梯度密度离心收集物；2)向包含流感病毒的介质中加入终浓度为5000μg/ml
±
500μg/ml的Triton X
‑
100，在10至30℃，至少搅拌1小时，不超3小时；3)在不低于8000g时，离心收集上清液；4)使上清液通过截留分子量为50kD的过滤器，用0....

【专利技术属性】
技术研发人员：韩博，张丽，马俊华，蒲瑞强，杨惠文，孙小丽，叶亚萍，
申请(专利权)人：江苏益明乐创医药科技有限公司，
类型：发明
国别省市：