亲水色谱偶联微升流速色质联用的糖蛋白质分析方法技术

本发明专利技术涉及一种基于亲水作用色谱偶联微升流速的液相色谱串联二级质谱的糖基化蛋白质组学分析方法。具体是取用生物样本后通过变性酶解蛋白获得肽段，除盐后提交至配置有点击麦芽糖微球填料的亲水作用色谱柱的液相色谱仪中用于富集样品中的完整糖肽，随后将富集后的样品提交至微升流速的液相色谱串联二级质谱进行完整糖肽的检测。本发明专利技术通过一定规格的色谱柱在特定的微升流速的液相色谱仪中分析生物样本的糖基化蛋白质组学，分析方法的重现性高，并且适合长期稳定运行，这种连续且自动化地富集大量样本的N

【技术实现步骤摘要】
亲水色谱偶联微升流速色质联用的糖蛋白质分析方法


[0001]本专利技术属于修饰蛋白质组学研究生物样本中生物标志物的定性定量分析方法领域，具体涉及将亲水作用色谱偶联微升流速的液相色谱串联二级质谱方法，应用于规模化临床生物样本中生物标志物的质谱定性和定量检测，是基于亲水作用色谱偶联微升流速的液相色谱串联二级质谱的糖基化蛋白质组学分析方法。

技术介绍

[0002]蛋白质糖基化是一种非常普遍、复杂和多样的蛋白质翻译后修饰(文献1.Moremen K W,Tiemeyer M,Nairn A V.Vertebrate protein glycosylation:diversity,synthesis and function.Nature Reviews Molecular Cell Biology,2012,13(7):448
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462.)。根据糖链和蛋白质连接方式的不同，蛋白质糖基化主要分为N
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糖基化、O
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糖基化、C
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糖基化和糖基磷脂酰肌醇(GPI)锚定4大类型，其中对N
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和O
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糖基化的研究最为广泛。在N
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糖基化中，糖链通过N
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乙酰葡萄糖胺与天冬酰胺侧链氨基共价结合，其糖链有五糖核心结构，糖基化位点具有特定肽段序列Asn
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X
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Ser/Thr(X≠Pro)。N
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糖基化在蛋白质稳定性、细胞内和细胞间信号转导、激素活化或失活和免疫调节等方面起着重要作用。蛋白质糖基化的异常表达也通常预示着相关疾病的发生发展，比如炎症、癌症、遗传病等(文献2.Schjoldager K T,Narimatsu Y,Joshi H J,Clausen H.Global view of human protein glycosylation pathways and functions.Nat Rev Mol Cell Biol,2020,21(12):729
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749.)。目前，大多数被批准临床使用的肿瘤生物标志物是糖蛋白(例如用于肝癌的甲胎蛋白(AFP)、用于卵巢癌的癌抗原125(CA125)、用于结肠癌的癌胚抗原(CEA)、用于前列腺癌的前列腺特异抗原(PSA)等)或糖抗原(例如用于胃肠癌和胰腺癌的癌抗原19
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9(CA19
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9)等)(文献3.Wang M,Zhu J,Lubman D M,Gao C.Aberrant glycosylation and cancer biomarker discovery:a promising and thorny journey.Clin Chem Lab Med,2019,57(4):407
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416.)。因此，糖蛋白质组学分析对于疾病的早期筛查和病理研究等非常重要。
[0003]基于质谱的蛋白质组学技术为全面分析蛋白质及其修饰提供了极好的分析手段(文献4.Suttapitugsakul S,Sun F,Wu R.Recent Advances in Glycoproteomic Analysis by Mass Spectrometry.Anal Chem,2020,92(1):267
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291.)。在自下而上的蛋白质组学研究中，单一蛋白或者复杂生物样品(细胞、组织、体液等)的全蛋白通常经酶解成肽段后再进行高效液相色谱串联质谱的定性和定量分析。然而，由于糖链的多样性和高度异质性，全面分析蛋白质糖基化仍具有很大的挑战。一方面，尽管蛋白质糖基化普遍存在，但是糖蛋白相对于全蛋白的丰度较低，而完整糖肽的含量更低，难以进行质谱的直接检测。因此，为了提高复杂生物样品中完整糖肽的丰度，发展完整糖肽的富集方法具有重要意义。目前，常见的糖肽富集技术有亲水作用色谱法、金属亲和色谱法、凝集素亲和色谱法、硼酸化学法、酶化学法、酰肼化学法等等(文献5.刘璐瑶,秦洪强,叶明亮.完整糖基化肽段的富集与质谱解析新技术研究进展.色谱,2021,39(10).)。其中亲水作用色谱法是一种广谱的富集方法，其通过糖肽和非糖肽之间极性的差异实现完整糖肽的分离和富集，并且富集糖肽
类型无偏差，同时能保留糖肽的完整结构。
[0004]目前，在亲水作用色谱法富集完整糖肽的实验流程中，由于没有商品化的微柱或者现有的商品化微柱效果不好，研究人员通常将富集材料填充至自制的微柱中，在离心辅助的微柱体系中进行平衡、上样、淋洗和洗脱等实验操作。这种传统的富集流程，其操作繁琐，受实验人员的影响大，不利于大量样本的分离分析。在2021年，我们发展了一种基于液相色谱仪的糖肽富集方法，该方法能够实现完整糖肽和非糖肽的自动化分离和收集，整个方法重现性高且易操作，能够长期运行，适合大队列样本的完整糖肽的分离富集实验(文献6.Liu L,Zhu B,Fang Z,Zhang N,Qin H,Guo Z,Liang X,Yao Z,Ye M.Automated Intact Glycopeptide Enrichment Method Facilitating Highly Reproducible Analysis of Serum Site
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Specific N
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Glycoproteome.Anal.Chem.,2021,93(20):7473
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7480.)。
[0005]纳流液相色谱已成为蛋白质组研究的中流砥柱超过20年，主要是因为低流速提高了肽段在质谱电喷雾中的电离效率，从而提高了灵敏度。但是长期稳定运行纳流液相色谱需要考虑色谱柱制造重现性、电喷雾稳定性、色谱柱过载、质谱饱和、以及低流速的上样时间长等因素，这些因素会限制肽段定性和定量的重现性以及蛋白质组分析的全面性、稳健性和通量。尤其是在分析以组织和体液为代表的高复杂性或蛋白质浓度动态范围宽的样品时，一个高稳定性的液相质谱平台非常重要。在2020年，Bian等发展了一种微流液相色谱串联质谱的方法用于蛋白质组学的研究，他们发现微流系统能够长期稳定运行，极大的提高了蛋白质组学质谱分析的稳定性(文献7.Bian Y,Zheng R,Bayer F P,Wong C,Chang Y
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C,Meng C,Zolg D P,Reinecke M,Zecha J,Wiechmann S,Heinzlmeir S,Scherr J,Hemmer B,Baynham M,Gingras A
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C,Boychenko O,Kuster B.Robust,reproducible and quantitative analysis of thousands of proteomes by micro
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flow LC
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MS/MS.Nat Commun,2020,11(1):157.)。随后，我们将该系统应本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.亲水作用色谱偶联微升流速色质联用的糖基化蛋白质组学分析方法，其特征在于：具体步骤如下：取生物样本，在变性剂中还原、烷基化处理；随后补加缓冲液，加入胰蛋白酶，酶解蛋白；酶解后酸化溶液并除盐，除盐后冻干酶解肽段；将酶解肽段重新复溶于富集上样液中，提交至配置有亲水作用色谱柱的液相色谱仪中，进行糖肽富集，监测流出曲线，收集糖肽馏分，冻干糖基化肽段；将糖基化肽段重新复溶于质谱上样液中，提交至配置有C18色谱柱、微升流速的液相色谱串联二级质谱中，进行色质联用分析方法的分离和检测，最后获得的raw文件用糖肽检索软件进行定性和定量分析。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：具体操作过程如下：1)取生物样本，分散于变性剂中，先加入还原剂在35～37℃环境下处理100～120min，随后加入烷基化试剂在20～25℃环境下处理30～40min；2)往步骤1)终溶液中补加变性剂体积4～8倍的缓冲液，并加入生物样本蛋白质量1/50～1/20倍的胰蛋白酶，在35～37℃环境下反应12～20h用于酶解蛋白；3)往步骤2)终溶液中加入三氟乙酸，使三氟乙酸占步骤2)终溶液总体积的0.1～1％，随后上样至除盐柱中，先加入除盐淋洗液，后加入除盐洗脱液，收集并冻干除盐后的洗脱液，即为酶解肽段；4)将步骤3)得到的酶解肽段重新复溶于富集上样液中，提交至配置有亲水作用色谱柱液相色谱仪中，进行糖肽富集，监测流出曲线，收集并冻干糖肽馏分，即为糖基化肽段；5)将步骤4)得到的糖基化肽段重新复溶于质谱上样液中，提交至配置有C18色谱柱、微升流速的液相色谱串联二级质谱中，进行色质联用分析方法的分离和检测，最后获得的raw文件用糖肽检索软件Glyco
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Decipher(版本1.0.2)得到完整糖肽的定性和定量结果。3.根据权利要求2所述方法，其特征在于：步骤1)所述生物样本可以为动物或人的血浆或血清5～10μL，或、动物或人的细胞或组织蛋白300～600μg；步骤1)所述变性剂为含有8M尿素的100mM碳酸氢铵缓冲溶液(pH 7.8～8.5)；步骤1)所述还原剂终浓度为15～25mM二硫苏糖醇溶液；步骤1)所述烷基化试剂终浓度为30～50mM的碘乙酰胺溶液；步骤2)所述缓冲液为50～150mM的碳酸氢铵溶液(pH 7.8～8.5)；步骤3)所述除盐柱为Waters公司的Oasis HLB C18小柱10～60mg；步骤3)所述除盐淋洗液为体积浓度0.1～1％三氟乙酸溶液；步骤3)所述除盐洗脱液为体积浓度80～82％乙腈(内含体积浓度0.1～1％三氟乙酸)溶液；步骤4)所述富集上样液为体积浓度80～82％乙腈(内含体积浓度0.1～0.3％三氟乙酸)溶液；步骤5)所述质谱上样液为体积浓度0.1～0.3％甲酸溶液。4.根据权利要求2所述方法，其特征在于：步骤4)所述亲水作用色谱柱，其填料为点击麦芽糖微球，其制备过程为：将硅烷偶联剂(结构为：X3Si
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(CH2)3‑
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【专利技术属性】
技术研发人员：叶明亮，刘璐瑶，
申请(专利权)人：中国科学院大连化学物理研究所，
类型：发明
国别省市：