一种大口黑鲈全雌不育种质的创制方法技术

本发明专利技术提供了一种大口黑鲈全雌不育种质的创制方法，属于鱼类生物育种技术领域。一种大口黑鲈全雌不育种质的创制方法，将大口黑鲈仔鱼进行性逆转处理，筛选XX型伪雄鱼；从性腺成熟的正常XX型雌鱼中收集卵子，向所述卵子转染抑制AMH基因表达的试剂，得到转染后的卵子；将从所述XX型伪雄鱼中分离的精子与所述转染后的卵子进行体外受精，得到的受精卵培育，得到大口黑鲈全雌不育种质。本发明专利技术提供的方法不仅能大大提高大口黑鲈生长速度与出肉率，还能保护核心种质，实现种源的自主可控。实现种源的自主可控。实现种源的自主可控。

【技术实现步骤摘要】
一种大口黑鲈全雌不育种质的创制方法


[0001]本专利技术属于鱼类生物育种
，具体涉及一种大口黑鲈全雌不育种质的创制方法。

技术介绍

[0002]大口黑鲈(Micropterus salmoides)又名加州鲈，源于北美湖泊和河流，1980年引入国内成功繁殖，因其生长速度快、适应性强、肉质鲜美而深受消费者喜爱，使养殖规模不断扩大。研究发现雌性大口黑鲈在生长速度比雄性快10％～15％，雌性在生长过程中展示出良好的生长优势。然而，在性成熟季节，随着精巢和卵巢的发育，雌性大口黑鲈生长速度明显下降，并且其性腺指数(性腺指数＝[性腺重量/(体重
‑
性腺重量)]×
100)可达10％～15％，而雄鱼的性腺指数小于1％。雌性大口黑鲈的性腺发育会大大影响大口黑鲈的生长速度和出肉率。

技术实现思路

[0003]有鉴于此，本专利技术的目的在于提供一种大口黑鲈全雌不育种质的创制方法，通过性逆转与RNA干扰技术制备一种全雌不育种质。
[0004]本专利技术提供了一种大口黑鲈全雌不育种质的创制方法，包括以下步骤：
[0005]将大口黑鲈仔鱼进行性逆转处理，筛选XX型伪雄鱼；
[0006]从性腺成熟的正常XX型雌鱼中收集卵子，向所述卵子转染抑制AMH基因表达的试剂，得到转染后的卵子；
[0007]将从所述XX型伪雄鱼中分离的精子与所述转染后的卵子进行体外受精，得到的受精卵培育，得到大口黑鲈全雌不育种质。
[0008]优选的，所述大口黑鲈仔鱼进行性逆转处理的方法，将大口黑鲈仔鱼在17α
‑
甲基二氢睾酮(MDHT)水溶液中浸泡。
[0009]优选的，所述17α
‑
甲基二氢睾酮水溶液的浓度为50～100μg/L。
[0010]优选的，所述浸泡的方法为每天浸泡1次，每次浸泡1.5～2.5h，连续浸泡29～32天。
[0011]优选的，所述筛选XX型伪雄鱼的方法为基于SEQ ID NO:1所示的分子标记检测鱼体的基因型，选择TT基因型且产精液的鱼体为XX型伪雄鱼。
[0012]优选的，所述抑制AMH基因表达的试剂为AMH反义RNA组或包含所述AMH反义RNA组的重组载体；
[0013]所述AMH反义RNA组包括核苷酸序列如SEQ ID NO:4所示的反义RNAI和核苷酸序列如SEQ ID NO:5所示的反义RNAII。
[0014]优选的，所述包含所述AMH反义RNA组的重组载体的骨架载体为含有T7启动子与CMV增强子的真核表达载体中。
[0015]优选的，所述转染时，每1000粒所述卵子与1ml抑制AMH基因表达的试剂混合；
[0016]所述抑制AMH基因表达的试剂为包含所述AMH反义RNA组的重组载体得到的PCR产物与盐水的混合物；
[0017]所述PCR产物采用正向引物和反向引物进行PCR扩增得到；
[0018]所述正向引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:6所示；
[0019]所述反向引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:7所示。
[0020]优选的，所述PCR产物与盐水的体积比为1:5；
[0021]所述盐水的质量百分含量为8
‰
。
[0022]优选的，所述正常XX型雌鱼或XX型伪雄鱼采用催产方式收集卵子或精子；
[0023]所述催产采用的催产素为含1500IU/mL绒毛膜促性腺激素、200μg/mL促黄体素释放激素类似物2号、10mg/mL马来酸地欧酮的水溶液；
[0024]所述正常XX型雌鱼的催产剂量为0.8～1.2mL催产混合剂/500g；
[0025]所述XX型伪雄鱼的催产剂量为0.4～0.6mL催产混合剂/500g。
[0026]本专利技术提供了一种大口黑鲈全雌不育种质的创制方法，本专利技术首先采用性逆转方法处理大口黑鲈仔鱼，筛选XX型伪雄鱼；从性腺成熟的正常XX型雌鱼中收集卵子，向所述卵子转染抑制AMH基因表达的试剂，得到转染后的卵子；将从所述XX型伪雄鱼中分离的精子与所述转染后的卵子进行体外受精，得到的受精卵培育，得到大口黑鲈全雌不育种质。本专利技术提供的创制方法结合了性逆转与生物育种手段，创制出一种大口黑鲈全雌不育新种质，有助于大大提高大口黑鲈生长速度与出肉率，同时保护核心种质，实现种源的自主可控。
附图说明
[0027]图1为Taqman实时荧光PCR检测试验鱼的遗传性别图；
[0028]图2为XX型试验鱼性腺(A)及组织发育(B)状况图；
[0029]图3为RNA干扰处理组与对照组性腺AMH基因表达结果；注：不同小写字母表示对照组在各时间点存在显著差异(P<0.05)；不同大写字母表示处理组在各时间点存在显著差异(P<0.05)；表示同一时间点下对照组与处理组存在显著差异(P<0.05)；
[0030]图4为RNA干扰处理组与对照组性腺组织HE染色分析结果。
具体实施方式
[0031]本专利技术提供了一种大口黑鲈全雌不育种质的创制方法，包括以下步骤：
[0032]将大口黑鲈仔鱼进行性逆转处理，筛选XX型伪雄鱼；
[0033]从性腺成熟的正常XX型雌鱼中收集卵子，向所述卵子转染抑制AMH基因表达的试剂，得到转染后的卵子；
[0034]将从所述XX型伪雄鱼中分离的精子与所述转染后的卵子进行体外受精，得到的受精卵培育，得到大口黑鲈全雌不育种质。
[0035]本专利技术将大口黑鲈仔鱼进行性逆转处理，筛选XX型伪雄鱼。
[0036]在本专利技术中，所述大口黑鲈仔鱼进行性逆转处理的方法，优选将大口黑鲈仔鱼在17α
‑
甲基二氢睾酮水溶液中浸泡。所述17α
‑
甲基二氢睾酮水溶液的浓度优选为50～100μg/L，更优选为80μg/L。所述浸泡的方法优选为每天浸泡1次，每次浸泡1.5～2.5h，连续浸泡29～32天，更优选为每次浸泡2h，连续浸泡30天。采用17α
‑
甲基二氢睾酮水溶液浸泡大口黑鲈
仔鱼，能够在性别发育时期将雌鱼(XX型)性别逆转，得到发育形成雄性性腺的伪雄鱼。
[0037]在本专利技术中，所述筛选XX型伪雄鱼的方法优选为基于SEQ ID NO:1(TTTGTTCATCACTTCATATTAACGCTGATTAAACTTATTAAACTTTGACTTGACAWCAGTTTGATAATTATTGTTTATCTGAATTAAACAAAGTTTTTGGCCGCGGAACAAAAAATAAATCTTGATTTTAGACACGTGCACGTGTGCGCGTGCGAGACGGAGCGCGCAAAAGAGCAGCAAACGGGATCGCGCGAGTTTCTGCGTTATCTCGGAAGTTTCTCT)所示的分子标记检测鱼体的基因型，选择TT基因型且产精液的鱼体为XX型伪雄鱼。所述检测用引物优选为核苷酸序列如SEQ ID NO:2本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种大口黑鲈全雌不育种质的创制方法，其特征在于，包括以下步骤：将大口黑鲈仔鱼进行性逆转处理，筛选XX型伪雄鱼；从性腺成熟的正常XX型雌鱼中收集卵子，向所述卵子转染抑制AMH基因表达的试剂，得到转染后的卵子；将从所述XX型伪雄鱼中分离的精子与所述转染后的卵子进行体外受精，得到的受精卵培育，得到大口黑鲈全雌不育种质。2.根据权利要求1所述创制方法，其特征在于，所述大口黑鲈仔鱼进行性逆转处理的方法，将大口黑鲈仔鱼在17α
‑
甲基二氢睾酮水溶液中浸泡。3.根据权利要求2所述创制方法，其特征在于，所述17α
‑
甲基二氢睾酮水溶液的浓度为50～100μg/L。4.根据权利要求2所述创制方法，其特征在于，所述浸泡的方法为每天浸泡1次，每次浸泡1.5～2.5h，连续浸泡29～32天。5.根据权利要求1所述创制方法，其特征在于，所述筛选XX型伪雄鱼的方法为基于SEQ ID NO:1所示的分子标记检测鱼体的基因型，选择TT基因型且产精液的鱼体为XX型伪雄鱼。6.根据权利要求1所述创制方法，其特征在于，所述抑制AMH基因表达的试剂为AMH反义RNA组或包含所述AMH反义RNA组的重组载体；所述AMH反义RNA组包括核苷酸序列如SEQ ID NO:4所示的反义RNA...

【专利技术属性】
技术研发人员：强俊，华吉祥，徐钢春，李岩，董亚伦，路思琪，陶易凡，姜冰洁，徐跑，
申请(专利权)人：中国水产科学研究院淡水渔业研究中心，
类型：发明
国别省市：