一种DNA电化学传感器及其制备方法和应用技术

本发明专利技术公开了一种DNA电化学传感器及其制备方法和应用，属于生物传感技术领域。本发明专利技术通过自组装将亚甲基蓝(MB)标记的巯基修饰的发夹DNA探针修饰到金电极上，制备了一种能够检测肿瘤相关TP53基因和单核苷酸多态性的DNA电化学传感器。该DNA电化学传感器具有制备过程简单，成本低，灵敏度高以及良好的重现性和存储稳定性等优点，为TP53基因突变位点的敏感和特异检测提供了强有力的工具，可用于癌症的早期诊断和预警。早期诊断和预警。早期诊断和预警。

【技术实现步骤摘要】
一种DNA电化学传感器及其制备方法和应用


[0001]本专利技术属于生物传感
，特别是涉及一种DNA电化学传感器、制备方法及其在肿瘤/癌症早期筛查和预警中的应用。

技术介绍

[0002]尽管医疗保健不断进步，癌症仍然是一种威胁生命的主要的疾病，涉及多个基因状态和表达的改变，每天导致超过1.5万人死亡，癌症治疗的关键在于早期发现、诊断和治疗。目前,用于癌症的早期检测的方法主要有血液检测芯片、基因检测、纳米检测、正电子发射断层扫描(PET)、计算机断层扫描(CT)等方法。这些方法可以提供非常准确的结果，但是仍然存在低灵敏度、高成本和潜在的物理或化学危害等缺点，在早期癌症检测方面非常有限。此外，酶联免疫吸附试验(ELISA)和聚合酶链反应(PCR)的技术由于具有高灵敏度和低侵入性被广泛关注，但它们需要较长的检测时间和较高的操作成本。因此迫切需要发展一种可靠、高效、灵敏、快速、价格低廉的癌症的早期筛查和预警的方法对医疗诊断至关重要。
[0003]肿瘤抑制基因TP53是人类癌症中最常见的突变基因之一，参与细胞周期控制和凋亡调节。它由11个外显子组成，编码含有393个氨基酸的p53蛋白，超过50％的人类肿瘤和癌细胞系中存在TP53基因或p53蛋白功能的改变。尽管大多数肿瘤抑制基因因缺失或截断突变而失活，但人类肿瘤中的TP53基因通常在编码蛋白质DNA结合域的外显子4
‑
8中具有突变。在该区域的突变中，以175、248、249、273、282位点的突变频率最高，通常出现在几乎所有类型的癌症中。TP53基因与癌症的密切关系，为癌症的早期筛查和预警创造了条件。
[0004]DNA电化学传感器是由DNA分子作为识别元件固定在基体电极上，利用基体电极将电化学信号转变为电信号，从而加以检测。DNA电化学传感器结合了DNA和电化学的优点，总体来说，包括以下几个方面的优势：1)、特异性好，DNA分子双链之间通过特定的碱基配对而具有非常高的特异性识别。2)、稳定性好，离体DNA比多数蛋白质(酶)分子的热稳定性好，制成的传感器可以保存较长时间。3)、成本低廉，制备简单，可以大批量合成。4)、灵敏度高，电化学响应快，操作简单。然而，电化学方法直接检测DNA产生的响应信号较低，微弱的响应信号容易受到噪声干扰，发生基线偏移，降低了仪器的灵敏度。

技术实现思路

[0005]鉴于此，本专利技术的目的是提供一种DNA电化学传感器及其制备方法和在肿瘤/癌症早期筛查和预警中的应用，本专利技术制备了一种能够检测肿瘤抑制基因TP53及其单核苷酸多态性的DNA电化学传感器，DNA电化学传感器检测肿瘤抑制基因TP53及其单核苷酸多态性的原理如下：目标TP53序列与电化学DNA传感器上固载的亚甲基蓝(MB)修饰的发夹DNA捕获探针作用后，通过DNA双链间的氢键作用引起的探针结构重排，导致标记的电化学指示剂亚甲基蓝远离电极表面，通过记录作用前后亚甲基蓝的电信号变化，可以有效识别TP53基因，实现DNA电化学传感器在纳摩尔浓度下对目标序列的有效检测；根据完全互补序列和存在单核苷酸多态性的序列的差分脉冲伏安信号差别，能够有选择性的识别TP53基因的单碱基突
变，实现肿瘤抑制基因TP53相关的肿瘤/癌症早期筛查和预警。
[0006]本专利技术目的是通过以下方式实现：
[0007]本专利技术提供一种用于肿瘤抑制基因TP53及其单核苷酸多态性检测的DNA电化学传感器的制备方法，主要包括如下步骤：
[0008](1)将电化学指示剂标记的单链DNA探针溶液与还原试剂溶液按照摩尔比为1:1～1000在室温下反应1～2小时，得到巯基修饰的单链DNA探针，所述还原试剂包括三(2
‑
羧乙基)膦、DTT、巯基乙醇和还原型谷胱甘肽；
[0009](2)将步骤(1)得到的巯基修饰的单链DNA探针的稀释溶液，滴加到活化后的金电极表面，1～10℃环境下反应12～16小时，得到单链DNA探针修饰的金电极；
[0010](3)将步骤(2)制备的单链DNA探针修饰的金电极浸入封闭剂的水溶液中，在室温下反应0.5～5小时，即得DNA电化学传感器，所述的封闭剂包括巯基己醇和巯基乙醇。
[0011]进一步地，步骤(1)所述的电化学指示剂包括但不限于亚甲基蓝、二茂铁。
[0012]进一步地，步骤(1)所述的电化学指示剂标记的单链DNA探针为3＇端修饰亚甲基蓝或二茂铁、5＇端修饰链间含二硫键的直链烷烃的发夹结构的单链DNA探针，浓度为0.1～1mM。
[0013]进一步地，步骤(1)所述的电化学指示剂标记的单链DNA探针的结构如下所示：5'
‑
C6
‑
S
‑
S
‑
C6
‑
GGC ATG AAC CGG AGG CCC ATC TCA TGC C
‑
MB
‑
3'。
[0014]进一步地，步骤(1)所述还原试剂溶液的浓度为10～100mM。
[0015]进一步地，步骤(2)所述巯基修饰的单链DNA探针的稀释溶液的浓度为0.1～10μM，滴加体积为2～10μL。
[0016]进一步地，步骤(2)所述活化后的金电极表面的处理过程为：在食人鱼溶液中清洗5～20分钟，然后依次在无水乙醇和去离子水中超声清洗，依次用粒径分别为1μm、0.3μm、0.05μm的三氧化二铝粉末将金电极表面抛光，然后依次在无水乙醇和去离子水中超声清洗。
[0017]进一步地，步骤(3)封闭剂的水溶液的浓度为1～10mM。
[0018]本专利技术另一方面提供由上述制备方法制得的DNA电化学传感器。
[0019]本专利技术再一方面提供上述的DNA电化学传感器在肿瘤抑制基因TP53及其单核苷酸多态性检测中的应用。
[0020]进一步地，所述肿瘤抑制基因TP53的单核苷酸多态性包括但不限于TP53基因第175、248、249、273、282位点突变。
[0021]本专利技术还提供了使用上述的DNA电化学传感器检测肿瘤抑制基因TP53的单核苷酸多态性的检测方法，主要包括如下步骤：
[0022](a)将DNA电化学传感器、参比电极和辅助电极置于检测缓冲体系中，进行差分脉冲伏安扫描并记录得到峰值电流I
a
；
[0023](b)取出DNA电化学传感器，将与DNA电化学传感器中的DNA完全互补的TP53基因序列水溶液滴加在传感器表面，杂交反应30～40分钟，缓冲溶液淋洗，得到杂交反应后的DNA电化学传感器；
[0024](c)将杂交反应后的DNA电化学传感器重新浸入到步骤(a)中的检测缓冲体系，进行差分脉冲伏安扫描并记录响应信号I
b
；
[0025](d)将完全互补的TP53基因序列水溶液替换成存在单核苷酸多态性的TP53基因水溶液，重复步骤(b)和(c)，得到响应信号I
c
；
[0026](e)通过比较电流下降百分比本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种DNA电化学传感器的制备方法，其特征在于，主要包括如下步骤：(1)将电化学指示剂标记的单链DNA探针溶液与还原试剂溶液按照摩尔比为1:1～1000反应，得到巯基修饰的单链DNA探针，所述还原试剂包括三(2
‑
羧乙基)膦、DTT、巯基乙醇和还原型谷胱甘肽；(2)将步骤(1)得到的巯基修饰的单链DNA探针的稀释溶液，滴加到活化后的金电极表面，1～10℃环境下反应12～16小时，得到单链DNA探针修饰的金电极；(3)将步骤(2)制备的单链DNA探针修饰的金电极浸入封闭剂的水溶液中，反应0.5～5小时，即得DNA电化学传感器，所述的封闭剂包括巯基己醇和巯基乙醇。2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤(1)所述的电化学指示剂包括但不限于亚甲基蓝、二茂铁。3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤(1)所述的电化学指示剂标记的单链DNA探针为3＇端修饰亚甲基蓝或二茂铁、5＇端修饰链间含二硫键的直链烷烃的发夹结构的单链DNA探针，浓度为0.1～1mM；所述还原试剂溶液的浓度为10～100mM。4.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，步骤(1)所述的电化学指示剂标记的单链DNA探针的结构如下所示：5'
‑
C6
‑
S
‑
S
‑
C6
‑
GGC ATG AAC CGG AGG CCC ATC TCA TGC C
‑
MB
‑
3'。5.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤(2)所述巯基修饰的单链DNA探针的稀释溶液的浓度为0.1～10μM，滴加体积为2～10μL。6.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤(2)所述活化后的金电极表面的...

【专利技术属性】
技术研发人员：孙鹏程，卢宪波，陈吉平，
申请(专利权)人：中国科学院大连化学物理研究所，
类型：发明
国别省市：