N6-甲基腺苷去甲基化酶活性的无标记灵敏检测方法技术

本发明专利技术提供一种N6

【技术实现步骤摘要】
N6
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甲基腺苷去甲基化酶活性的无标记灵敏检测方法


[0001]本专利技术涉及一种N6
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甲基腺苷去甲基化酶活性的无标记灵敏检测方法，属于生物分析


技术介绍

[0002]N6
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甲基腺苷(m6A,N6位腺苷甲基化)是最丰富的RNA修饰类型，它调节多种RNA代谢过程，如翻译起始、RNA剪接、核输出和mRNA衰变。N6
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甲基腺苷修饰是动态可逆的，可以通过N6
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甲基腺苷甲基转移酶安装，也可以通过N6
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甲基腺苷去甲基化酶去除。到目前为止，仅鉴定出两种N6
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甲基腺苷去甲基化酶，包括AlkB同源物5和肥胖相关蛋白，它们都以依赖Fe
2+
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和α
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酮戊二酸的方式诱导N6
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甲基腺苷去甲基化。N6
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甲基腺苷去甲基化酶的失调会扰乱正常的N6
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甲基腺苷甲基化模式，导致各种人类疾病的发生，如类风湿关节炎、糖尿病、急性髓性白本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种N6
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甲基腺苷去甲基化酶活性的无标记灵敏检测方法，其特征在于，该方法具体步骤如下：步骤1，将环状DNA与不同浓度细胞提取物加入到含有N6
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甲基腺苷去甲基酶反应缓冲溶液中，反应后得到去甲基化后的环状DNA底物；然后添加引物1与去甲基化后的环状DNA在退火缓冲溶液下进行退火，生成双链DNA产物；步骤2，将生成的dsDNA产物加入到含有DpnI，rCutSmart缓冲液的反应体系中进行切割反应；之后，在反应体系中加入BstDNA聚合酶，引物2和dNTPs进行反应，从而得到超支化滚环扩增产物；其中，DNA是脱氧核糖核酸；DpnI为限制性内切酶可识别Gm6A^TC位点；rCutSmart为DpnI产品中自带的反应缓冲液；BstDNA聚合酶是一种具有链置换活性和5'
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3'聚合酶活性的耐热DNA聚合酶；dNTPs是脱氧核糖核苷酸三磷酸；步骤3，最后，将SYBRGold加入到该体系中，并于室温下孵育，测荧光得到指数化放大的荧光信号；其中，SYBRGold是荧光核酸凝胶染料。2.根据权利要求1所述的N6
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甲基腺苷去甲基化酶活性的无标记灵敏检测方法，其特征是，所述N6
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甲基腺苷去甲基化酶反应缓冲溶液包括L
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抗坏血酸，(NH4)2...

【专利技术属性】
技术研发人员：张春阳，马飞，李娜，
申请(专利权)人：东南大学，
类型：发明
国别省市：