一种基于双荧光探针检测多类型核酸突变的方法技术

本发明专利技术涉及生物技术领域，尤其涉及一种基于双荧光探针检测多类型核酸突变的方法。该方法包括：设计涵盖突变位置的上下游扩增引物，并且针对突变位置设计荧光探针A，其序列与待测序列的野生型靶序列相匹配；设计荧光探针B，用于检测待测序列的物种特异性保守靶序列，荧光探针B与荧光探针A的设计位置位于同一模板链，荧光探针A和B的设计位置位于所述上下游扩增引物之间且完全不重叠，根据荧光探针A与荧光探针B的荧光信号CT值的差值，判断核酸突变情况。该方法可检测荧光探针A覆盖范围之内所有类型单一点突变或者多点突变类型，灵敏度高，特异型强，检测线性范围宽。检测线性范围宽。检测线性范围宽。

【技术实现步骤摘要】
一种基于双荧光探针检测多类型核酸突变的方法


[0001]本专利技术涉及生物
，尤其涉及一种基于双荧光探针检测多类型核酸突变的方法。

技术介绍

[0002]基因突变是生物基因组核酸分子出现的可遗传的变异现象，其基因在结构上发生碱基对组成或排列顺序的改变。研究表明，基因突变与疾病的发生、病原菌的耐药、毒力改变均有密切关联，突变的类型主要包括碱基缺失、插入以及点突变。其中碱基缺失/插入会造成突变位点之后的碱基序列移位，进而引发突变点后所有核酸序列变化，其突变检测难度较小。目前，核酸突变检测中难度最大的是单碱基突变的检测。由于序列中只有1个碱基发生突变，常规的检测技术通常难以区分。
[0003]目前检测单碱基突变的技术有以下几种方法：1、PCR扩增测序法：使用普通PCR对目的片段扩增后产物进行测序分析，该方法可以检测目的片段上的多种突变，但其扩增依赖于PCR，检测灵敏度较低，且耗时长。2、PCR
‑
RFLP法：依据点突变位置序列选择特异的限制性内切酶进行PCR产物切割达到检测目的。如果该位置发生了突变，选择的特异的限制性内切酶将会不识别该位点，无法进行切割，从而依据酶切产物来鉴别位点是否突变。该方法检测灵敏度低，费时费力，且仅能检测特定碱基的突变，目前已很少使用。3、高分辨率熔解曲线法：利用荧光PCR技术，检测靶序列的特定Tm值，如果靶序列上存在突变，则会引起Tm值的微小变化。相比测序法其检测灵敏度有所提升，但靶序列上除目的突变外的其他位置的SNP也会改变靶序列的Tm值，引起Tm值不固定的变化，造成结果判读错误。4、水解探针法：该方法是目前单碱基突变检测最常用的方法，一般使用小沟结合蛋白（MGB）或锁核酸修饰的短探针来检测，针对突变位点，分别设计一条野生型结合探针和一条突变型结合探针，两条探针标记两种荧光。由于结合能力的差异，当检测靶位点为野生型基因序列时，与野生型探针结合能力远强于突变型，竞争性结合在靶位点，体系检测为野生型探针荧光信号；同理，突变时检测为突变型荧光探针信号。该方法在目前单碱基突变中检测灵敏度最高，但依旧存在难以克服的缺点，即每种类型的单碱基突变都必须设计对应的突变探针，否则会造成漏检。这使得该方法通常只检测一种类型点突变，最多检测2
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3种点突变，过多的突变类型会降低探针检测的灵敏度，影响区分度。5、质谱法：该方法为近些年发展的一种较新的检测技术，通过在单碱基突变位点前设计特异性质谱探针，利用单碱基延伸技术，可以检测突变位点的所有突变类型，同时也可以对多个突变位点进行检测，但该方法依赖于PCR扩增，检测灵敏度较低，同时还需要专门的大型质谱仪作为硬件支撑，难以广泛推广使用。
[0004]综上所述，单碱基突变检测方法非常多，各有优缺点。但总体来说，检测灵敏度高的方法，对于点突变检测的类型难以全面覆盖；能够检测多类型点突变的方法，其检测灵敏度又有所欠缺。
[0005]因此，本领域缺少一种可以检测多种类型点突变的高灵敏度方法。

技术实现思路

[0006]为解决上述技术难题，本专利技术以点突变检测的水解探针技术为基础，提供了一种高灵敏度和特异性的基于双探针的全类型点突变检测方法。
[0007]首先，本专利技术提供了一种核酸突变的检测方法，包括：设计涵盖突变位置的上下游扩增引物，并且针对突变位置设计荧光探针A，荧光探针A的序列与待测序列的野生型靶序列相匹配；设计荧光探针B，用于检测待测序列的物种特异性保守靶序列，荧光探针B与荧光探针A的设计位置位于同一模板链，荧光探针A和B的设计位置位于所述上下游扩增引物之间，且荧光探针Ｂ的设计位置与荧光探针A的设计位置完全不重叠；使用所述上下游扩增引物、荧光探针A和荧光探针B检测待测序列；根据荧光探针A与荧光探针B的荧光信号CT值的差值，判断核酸突变情况。
[0008]本专利技术中的野生型靶序列为无突变序列。
[0009]在具体实施过程中，采用荧光PCR技术检测荧光信号CT值；所述荧光PCR技术的扩增条件包括：94
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98℃变性，10
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30s，60
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68℃退火，10
‑
30s，循环40
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45次。
[0010]在具体实施过程中，采用含有所述上下游扩增引物、荧光探针A和荧光探针B的检测体系检测所述待测序列。
[0011]所述检测体系中还包括但不限于缓冲物质。
[0012]优选地，所述检测方法还包括：设置待测序列的未突变野生型序列作为结果判定对照，采用与检测待测序列相同的检测体系检测所述结果判定对照。
[0013]优选地，控制所述结果判定对照的两种荧光信号CT值的差值的绝对值在0.2个单位之内；然后根据待测序列的两种荧光信号CT值的差值判断核酸突变情况。
[0014]在检测野生型模板时，荧光探针A与荧光探针B均可以与模板完全匹配，结合能力相当，检测过程中两者扩增产生的荧光信号是同步的，因此体现在扩增曲线上，两种荧光信号的CT值几乎一致（图1A）。检测突变型时，该突变位置理论上可以位于荧光探针A覆盖的任意区域，但实际操作中尽量位于探针中部，更好提升检测能力。点突变类型可以为任意类型的转换或颠换（例：该突变可以是突变株甲A碱基位置的A
→
G/C/T突变（图1B），也可是突变株乙G碱基位置的G
→
A/C/T突变（图1C），或者其他位置的点突变以及突变叠加均可）。由于荧光探针A对应的模板核酸序列存在点突变，导致模板与荧光探针A的结合能力大幅下降，而荧光探针B和模板序列完全匹配，因此扩增过程中B荧光的检测CT值不受任何影响，而A探针由于结合能力大幅下降导致其检测CT值以及荧光信号强度大幅度推迟（图1B、C）。
[0015]在一些实施方案中，根据突变位置的数量，在同一检测体系中设计一个或多个荧光探针A。
[0016]优选地，所述上下游扩增引物的设计位点位于突变位置的上下游300bp以内。
[0017]优选地，荧光探针A和荧光探针B的Tm值比上游扩增引物或下游扩增引物的Tm值高5~10℃。
[0018]在一些实施方案中，荧光探针A和荧光探针B的荧光基团不同。
[0019]所述荧光包括但不限于FAM和VIC荧光。
[0020]在一些实施方案中，所述荧光探针A或荧光探针B独立地选自：MGB探针、LNA探针、
分子信标探针、TaqMAN探针。
[0021]在一些实施方案中，荧光探针A为具备单碱基区分能力的水解探针。
[0022]在一些实施方案中，荧光探针B为具备高灵敏度和高特异性检测能力的探针。
[0023]在一些实施方案中，荧光探针的5
’
端标记荧光基团，3
’
端修饰BHQ1基团或者小沟结合蛋白（MGB），或者对部分碱基进行锁核酸修饰。
[0024]优选地，两种荧光信号CT值的差值的绝对值为
△
CT（
△
CT=|CT...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种核酸突变的检测方法，其特征在于，包括：设计涵盖突变位置的上下游扩增引物，并且针对突变位置设计荧光探针A，荧光探针A的序列与待测序列的野生型靶序列相匹配；设计荧光探针B，用于检测待测序列的物种特异性保守靶序列，荧光探针B与荧光探针A的设计位置位于同一模板链，荧光探针A和B的设计位置位于所述上下游扩增引物之间，且荧光探针Ｂ的设计位置与荧光探针A的设计位置完全不重叠；使用所述上下游扩增引物、荧光探针A和荧光探针B检测待测序列；根据荧光探针A与荧光探针B的荧光信号CT值的差值，判断核酸突变情况。2.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，采用荧光PCR技术检测荧光信号CT值；所述荧光PCR技术的扩增条件包括：94
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98℃变性，10
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30s，60
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68℃退火，10
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30s，循环40
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45次。3.根据权利要求2所述的检测方法，其特征在于，还包括：设置待测序列的未突变野生型序列作为结果判定对照，采用与检测待测序列相同的检测体系检测所述结果判定对照。4.根据权利要求3所述的检测方法，其特征在于，控制所述结...

【专利技术属性】
技术研发人员：赵飞，刘立雍，何利华，孟凡亮，龚杰，张建中，
申请(专利权)人：中国疾病预防控制中心传染病预防控制所，
类型：发明
国别省市：