基于靶向测序的真菌检测引物探针、试剂盒及检测方法技术

本发明专利技术涉及微生物检测技术领域，具体涉及基于靶向测序的真菌检测引物探针、试剂盒及检测方法。本发明专利技术通过筛选和优化，获得了病原真菌靶向测序的引物组合和检测方法，将所述引物组和检测方法应用于病原真菌的检测，检出率高、特异性高、灵敏性好，能够检测到低至20copies/μL，具有广泛的应用前景，为临床真菌感染诊断提供了技术支撑。菌感染诊断提供了技术支撑。

【技术实现步骤摘要】
基于靶向测序的真菌检测引物探针、试剂盒及检测方法


[0001]本专利技术涉及微生物检测
，具体涉及基于靶向测序的真菌检测引物探针、试剂盒及检测方法。

技术介绍

[0002]侵袭性真菌感染(Invasive fungal infections，IFI)是住院、免疫功能低下患者发病和死亡的重要原因。随着大量广谱抗生素的使用，器官移植、抗肿瘤药物及免疫抑制剂的应用、导管介入治疗，侵袭性真菌感染的发病率逐年增加。在住院治疗过程中，患者身体免疫力不断下降，由于细菌、真菌联合感染导致的死亡越来越多，而对这些系统性真菌感染的诊断和治疗却非常困难。
[0003]目前的检测方法主要依靠镜检法、培养法、组织病理学、血清学方法和分子生物学方法。微生物培养法和组织病理学检查是真菌感染的传统检测方法，但其存在着取样困难、培养时间长、需多次培养，对检验人员要求较高等缺点。相比于组织病理学和培养发，镜检法更快捷、成本更低，但主观因素对镜检影响较大、且需要较高的检验技术，影像学检查特异程度较低，临床意义有限。血清学检测易出现假阳性结果，不能精确鉴定菌种，不能检测隐球菌和接合菌的感染等弊端。如今，新型分子诊断技术不断出现，为临床诊断提供了新的帮助，包括：传统PCR、RT
‑
PCR、CRISPER(恒温扩增)、mNGS(宏基因组二代测序)等。这些分子水平上的诊断技术在临床应用中的优势越来越明显，尤其是mNGS技术，能快速准确检测出病原体的种类及丰度，对于临床诊断具有重要大价值。但是mNGS技术针对细菌和病毒检测的准确度和特异性更好一些，对于真菌的检测仍然存在较大的挑战。一是因为真菌感染的丰度相比于细菌和病毒都偏低，二是真菌破壁困难、核酸提取浓度低，三是真菌序列与人类相似度高、数据库不完整、系统识别不准确。由于这三方面的原因导致检测灵敏度低，容易漏检，往往需要检测数据量更大，大大增加了检测的成本。使其在临床难以广泛推广。

技术实现思路

[0004]有鉴于此，本专利技术要解决的技术问题在于提供基于靶向测序的真菌检测引物探针、试剂盒及检测方法。
[0005]本专利技术提供了病原真菌靶向测序的引物组合，其包括：
[0006]保守序列引物组和特异序列引物组
[0007]所述保守序列引物组包括如SEQ ID NO:1～SEQ ID NO:6任意所示核苷酸序列的引物；
[0008]所述特异序列引物组包括如SEQ ID NO:7～SEQ ID NO:66任意所示核苷酸序列的引物。
[0009]进一步的，
[0010]所述保守序列引物组包括：
[0011]具有如SEQ ID NO:1所示的上游引物，具有如SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:3所示的
下游引物；和/或
[0012]具有如SEQ ID NO:4或SEQ ID NO:6所示的上游引物，具有如SEQ ID NO:5所示的下游引物；
[0013]本专利技术中，具体的，所述保守序列引物组包括：
[0014]如SEQ ID NO:1所示核苷酸序列的上游引物，如SEQ ID NO:2所示核苷酸序列的下游引物；和
[0015]如SEQ ID NO:1所示核苷酸序列的上游引物，如SEQ ID NO:3所示核苷酸序列的下游引物；和
[0016]如SEQ ID NO:4所示核苷酸序列的上游引物，如SEQ ID NO:5所示核苷酸序列的下游引物；和
[0017]如SEQ ID NO:6所示核苷酸序列的上游引物，如SEQ ID NO:5所示核苷酸序列的下游引物。
[0018]所述特异序列引物组包括：
[0019]具有如SEQ ID NO:(2X
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1)所示的核苷酸序列上游引物，具有如SEQ ID NO:(2X)所示的核苷酸序列的下游引物；其中，X选自4～33中的任意整数。
[0020]本专利技术提供了试剂盒，其包括本专利技术所述的引物组合。
[0021]进一步的，本专利技术所述试剂盒还包括PCR扩增试剂、缓冲液和/或DNA提取纯化试剂中的至少一种。
[0022]本专利技术提供了非诊断目的的基于靶向测序的真菌病原菌的检测方法，其包括利用本专利技术所述的引物组合或本专利技术所述的试剂盒对样本进行检测。
[0023]进一步的，本专利技术所述的检测方法，包括如下步骤：
[0024]步骤1、获取样本DNA；
[0025]步骤2、利用本专利技术所述的引物组对所述样本DNA进行PCR扩增；
[0026]步骤3、对所述扩增获得的产物进行高通量测序和生物信息学分析，获得病原菌检测结果。
[0027]所述PCR扩增的反应体系包括：5
×
multiplex mix缓冲液、0.1U/μl的Multiplexmix polymerase、500μM的dNTP mix、0.5μM的保守序列引物组、20nM的特异性引物组、50ng/μl～100ng/μl的DNA。
[0028]所述PCR扩增的反应条件包括：
[0029]95℃，10min；(95℃30s，58℃2min；60℃3min；62℃1min；72℃1min)
×
5循环，(95℃30s；66℃3min)
×
30循环。
[0030]本专利技术所述的检测方法中，
[0031]样本为肺泡灌洗液、脑脊液、胸腹水或痰液中的任意一种，则需要在获取样本DNA前进行前处理；
[0032]所述前处理包括如下步骤：样本与缓冲液混匀后进行均质处理；
[0033]进一步的，
[0034]所述样本与缓冲液的体积比为1：4；
[0035]所述均质处理的参数设置为SPEED：6.9(M/S)，CYCLE：9，TIME：30(S)，INTER：1(MIN)。
[0036]本专利技术的一些具体的实施例中，所述前处理的步骤包括：取200μL样本和800μL PBS缓冲液充分混匀，至2.0mL振荡管底部。平衡放入匀质仪中，运行程序：SPEED：6.9(M/S)，CYCLE：9，TIME：30(S)，INTER：1(MIN)。运行结束后，取出震荡管，吸取上清液至2mL离心管中。
[0037]本专利技术对所述的检测方法中涉及的参数步骤进行了优化，具体包括前处理方式的选择和前处理参数的设置；
[0038]在本专利技术的一些具体的实施例中，所述前处理利用ultrasonic(超声)、震荡(Shock)、酶处理(Enzyme)、煮沸(Boiled)以及未前处理相比，震荡(Shock，本专利技术的前处理方式)可实现5种菌的全部检出，检出准确性高、特异性高、灵敏性好。
[0039]本专利技术的另一些实施例中，对保守序列引物组进行了筛选，所述保守序列引物组是根据真菌ITS序列设计，为可实现真菌检测的通用引物，实验结果表明，本专利技术中使用的如SEQ ID NO:1～SEQ ID NO:6所示的保守序列引物组扩增效果更好，检出率更高。并且我们通过通用引物本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.病原真菌靶向测序的引物组合，其特征在于，包括：保守序列引物组和特异序列引物组所述保守序列引物组包括如SEQ ID NO:1～SEQ ID NO:6任意所示核苷酸序列的引物；所述特异序列引物组包括如SEQ ID NO:7～SEQ ID NO:66任意所示核苷酸序列的引物。2.根据权利要求1所述的引物组合，其特征在于，所述保守序列引物组包括：如SEQ ID NO:1所示核苷酸序列的上游引物，如SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:3所示核苷酸序列的下游引物；和/或如SEQ ID NO:4或SEQ ID NO:6所示核苷酸序列的上游引物，如SEQ ID NO:5所示核苷酸序列的下游引物；所述特异序列引物组包括：具有如SEQ ID NO:(2X
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1)所示的核苷酸序列上游引物，具有如SEQ ID NO:(2X)所示的核苷酸序列的下游引物；其中，X选自4～33中的任意整数。3.试剂盒，其特征在于，包括权利要求1或2所述的引物组合。4.根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括PCR扩增试剂、缓冲液和/或DNA提取纯化试剂中的至少一种。5.非诊断目的的基于靶向测序的真菌病原菌的检测方法，其特征在于，包括利用如权利要求1或2所述的引物组合或权利要求3或4所述的试剂盒对样本进行检测。6.根据权利要求5所述的检测方法，其特征在于，包括如下步骤：步骤...

【专利技术属性】
技术研发人员：顾兵，李广华，胡雪姣，孟玥，袁凯旋，刘莉莉，姚瑶，朱莉莉，高晓庆，韩序，王珺，
申请(专利权)人：广东省人民医院，
类型：发明
国别省市：