一种磁珠结合高速低温匀浆机分离组织线粒体的方法技术

本发明专利技术涉及一种磁珠结合高速低温匀浆机分离组织线粒体的方法，属于生物医药技术领域。包括：在恒温低温环境下，将经过机械剪切和/或胶原酶消化后的组织碎块置于线粒体分离试剂中，在分离试剂中加入磁珠，在高速低温匀浆机中进行研磨，得到组织破碎后的混悬液，离心去除细胞碎片，再离心收集线粒体。本发明专利技术创新性地改进了组织线粒体分离程序中最重要的组织破碎部分，使得不同组织能够特异性地在较为恒定的低温环境中，在一定体积阈值之上，分离出完整的线粒体，提高了分离效率。本发明专利技术通过使用磁珠法，在高速低温匀浆机中进行组织破碎，能够提高线粒体的分离效率，保证线粒体的完整性和活性，具备极佳的应用价值。具备极佳的应用价值。具备极佳的应用价值。

【技术实现步骤摘要】
一种磁珠结合高速低温匀浆机分离组织线粒体的方法


[0001]本专利技术涉及一种磁珠结合高速低温匀浆机分离组织线粒体的方法，属于生物医药


技术介绍

[0002]线粒体作为细胞的动力工厂，在生理和病理状态下都发挥着不可忽视的作用，尤其在高耗能器官中，如心脏；线粒体对相关疾病的发生发展有显著影响，因此线粒体也一直作为可供选择的疾病干预靶点，受到广泛的关注和研究。既往的研究中，对线粒体的研究大多数限定在细胞水平，而随着近几年线粒体相关技术的飞速发展，对线粒体的研究已经逐渐深入到亚细胞器水平。
[0003]在亚细胞水平上研究线粒体的功能变化，将线粒体从单细胞中完整地分离是关键的第一步。现有技术中分离细胞中的物质，例如蛋白质、外泌体等，通常采用表面活性剂等化学方式或者消化酶等生物方式先破坏细胞膜，但这一类的方法往往会对细胞内同样具有膜结构的细胞器产生不可控的损伤。线粒体是具有膜结构的细胞器，且线粒体与细胞的体积相差巨大，因此分离线粒体时通常采用物理机械分离的方式，在同一水平的剪切力、摩擦力作用下，机械力量对于物体的破碎作用限定在一定的体积大小阈值中，能够最大限度的保存分离的线粒体。
[0004]既往通常使用研磨杵或者超声的方式进行组织破碎，这些方法或多或少需要手工操作，且在分离过程中难以保持均衡的温度，具有不稳定性；现有技术中线粒体的分离效率低，不能很好地保证线粒体的完整性和活性；所以，本
亟需一种分离效率高，可以更好地保证线粒体的完整性和活性的组织线粒体分离方法。

技术实现思路

[0005]本专利技术的目的是为解决如何获得一种分离效率高，可以更好地保证线粒体的完整性和活性的组织线粒体分离方法的技术问题。
[0006]为达到本专利技术的目的，本专利技术提供一种磁珠结合高速低温匀浆机分离组织线粒体的方法，包括：在恒温低温环境下，将经过机械剪切和/或胶原酶消化后的组织碎块置于线粒体分离试剂中，在分离试剂中加入磁珠，在高速低温匀浆机中进行研磨，得到组织破碎后的混悬液，离心去除细胞碎片，再离心收集线粒体。
[0007]优选地，所述组织包括硬组织或软组织；所述硬组织包括心脏或腓肠肌；所述软组织包括肝脏或肾脏。
[0008]优选地，所述磁珠的材质为钢珠或锆珠。
[0009]优选地，所述磁珠的粒径相同。
[0010]优选地，所述方法中在高速低温匀浆机中进行研磨时，根据组织的不同以及组织软硬度的不同，选择不同粒径的磁珠，所述磁珠的粒径为0.5
‑
4mm。
[0011]优选地，所述方法中在高速低温匀浆机中进行研磨时，根据组织的不同以及组织
软硬度的不同，选择数量不同的磁珠。
[0012]优选地，所述方法中在高速低温匀浆机中进行研磨的频率和次数根据组织软硬度不同进行调节，高速低温匀浆机研磨的频率为40
‑
100Hz，每次研磨的时间为20
‑
40s。
[0013]优选地，所述方法中离心去除细胞碎片的过程中离心的转速为500
‑
700g，所述离心收集线粒体的过程中离心的转速为10000
‑
12000g。
[0014]本专利技术提供根据上述的方法在制备组织线粒体中的应用。
[0015]相比现有技术，本专利技术具有如下有益效果：
[0016]本专利技术通过使用磁珠与组织混合，在低温下进行高速破碎，磁珠的大小相同，使得其在同一频率下的震荡幅度和力度较为均匀，可以通过改变磁珠的颗粒数、大小，以及高速低温匀浆机的震荡频率控制破碎阈值，使之适应不同的软组织或者硬组织，不仅使组织线粒体地分离更好地适应组织特异性，还能提高线粒体的分离效率，更好地保持线粒体的完整性和活性。
[0017]本专利技术创新性地改进了组织线粒体分离程序中最重要的组织破碎部分，使得不同组织能够特异性地在较为恒定的低温环境中，在一定体积阈值之上，分离出完整的线粒体，并提高了分离效率。本专利技术通过使用磁珠法，在高速低温匀浆机中进行组织破碎，能够提高线粒体的分离效率，保证线粒体的完整性和活性，在研究线粒体相关课题时具备极佳的应用价值。
附图说明
[0018]图1为磁珠结合高速低温匀浆机提取出的心肌组织线粒体的电镜图。
具体实施方式
[0019]为使本专利技术更明显易懂，兹以优选实施例，并配合附图作详细说明如下：
[0020]本专利技术提供一种磁珠结合高速低温匀浆机分离组织线粒体的方法，包括：在恒温低温环境下，将经过机械剪切和/或胶原酶消化后的组织碎块置于线粒体分离试剂中，在分离试剂中加入磁珠，在高速低温匀浆机中进行研磨，得到组织破碎后的混悬液，离心去除细胞碎片，再离心收集线粒体。上述组织包括硬组织或软组织；硬组织包括心脏或腓肠肌；软组织包括肝脏或肾脏。上述磁珠的材质为钢珠或锆珠；磁珠的粒径相同；
[0021]上述方法中在高速低温匀浆机中进行研磨时，根据组织的不同以及组织软硬度的不同，选择不同粒径的磁珠，所述磁珠的粒径为0.5
‑
4mm。
[0022]上述方法中在高速低温匀浆机中进行研磨时，根据组织的不同以及组织软硬度的不同，选择数量不同的磁珠。
[0023]上述方法中在高速低温匀浆机中进行研磨的频率和次数根据组织软硬度不同进行调节，高速低温匀浆机研磨的频率为40
‑
100Hz，每次研磨的时间为20
‑
40s。
[0024]上述方法中离心去除细胞碎片的过程中离心的转速为500
‑
700g，所述离心收集线粒体的过程中离心的转速为10000
‑
12000g。
[0025]实施例
[0026]本实施例提供了一种使用磁珠结合高速低温匀浆机分离组织线粒体的方法，包括以下步骤：
[0027]1.准备0.5mm、1mm、2mm、3mm、4mm等不同规格的钢珠或锆珠，用于加入到不同组织中，在高速低温匀浆机中进行组织破碎；
[0028]2.从新鲜动物尸体中取出组织，通常有心脏、腓肠肌等硬组织，肝脏、肾脏等软组织，将组织取出后使用PBS冰浴，并在冰上用剪刀迅速剪碎以清除组织中的血液，然后在冰上使用胶原酶消化10min，随后将液体置换成线粒体分离试剂，并加入不同大小、材质的无菌研磨珠(钢珠或锆珠)，在高速低温匀浆机中应用60Hz的频率研磨(30s
×
4次)，得到组织破碎后的混悬液，600g离心去除细胞碎片，11000g离心收集线粒体。
[0029]3.将分离得到的线粒体进行透射电镜扫描，比较观察分离得到的线粒体的纯度、形状、完整性，以及线粒体嵴等微观结构的稳定性。同时，利用SeaHorse、流式细胞术、ATP检测、PO
‑
puro检测等方法，比较观察不同缓冲体系分离出来的线粒体的活性。
[0030]图1为采用上述方法分离的心肌组织线粒体的电镜图，能够看到线粒体大小正常、形态完整
[0031]本专利技术通过磁珠结合高本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种磁珠结合高速低温匀浆机分离组织线粒体的方法，其特征在于，包括：在恒温低温环境下，将经过机械剪切和/或胶原酶消化后的组织碎块置于线粒体分离试剂中，在分离试剂中加入磁珠，在高速低温匀浆机中进行研磨，得到组织破碎后的混悬液，离心去除细胞碎片，再离心收集线粒体。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述组织包括硬组织或软组织；所述硬组织包括心脏或腓肠肌；所述软组织包括肝脏或肾脏。3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述磁珠的材质为钢珠或锆珠。4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述磁珠的粒径相同。5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述方法中在高速低温匀浆机中进行研磨时，根据组织的不同以及组织软硬度的不同，选择不同粒径的磁珠，所述磁珠的粒径为0.5
‑
4mm。6...

【专利技术属性】
技术研发人员：孙爱军，葛均波，黄涯，孙晓垒，董震，
申请(专利权)人：复旦大学附属中山医院，
类型：发明
国别省市：