一种鉴别马苏大麻哈鱼幼鱼性别的方法技术

本发明专利技术公开了一种鉴别马苏大麻哈鱼幼鱼性别的方法，是以马苏大麻哈鱼雄性特异标记OtY2基因组序列（GU181208）为目标产物而设计了三对PCR引物，灵敏度高、特异性好，只需1

【技术实现步骤摘要】
一种鉴别马苏大麻哈鱼幼鱼性别的方法


[0001]本专利技术涉及水产养殖领域，尤其是一种鉴别马苏大麻哈鱼幼鱼性别的方法。

技术介绍

[0002]马苏大麻哈鱼（Oncorhynchus masou）主要分布于图们江、黑龙江和绥芬河流域，历史上是我国北方地区特有的经济鱼类之一，年捕捞量达50万吨。但是，由于人类活动导致的栖息地丧失、无节制捕捞、增殖放流资源不足等原因，马苏大麻哈鱼自然种群濒临灭绝，全国各流域年洄游量总和不足1万尾且分布区狭小，仅在吉林省密江河保存有陆封型种群，现已被列为国家二级保护动物。
[0003]目前，马苏大麻哈鱼的资源养护和物种保护主要以放流人工繁育的幼鱼为主，并通过捕捞成熟后的马苏大麻哈鱼完成新一代幼鱼的培育和增殖放流，因此，亲鱼中雌性个体的数量决定幼鱼的培育数量和增殖放流站的养殖效率。然而，马苏大麻哈鱼在个体发育早期（幼鱼）无法确定性别，只能待性腺成熟之后采用微创手术或者内窥镜方法进行鉴别，对鱼类造成较大损伤，同时难以在有限的养殖空间最大限度地饲养雌性个体，限制了增殖放流效率。

技术实现思路

[0004]本专利技术是为了解决现有技术所存在的上述技术问题，提供一种鉴别马苏大麻哈鱼幼鱼性别的方法。
[0005]本专利技术的技术解决方案是：一种鉴别马苏大麻哈鱼幼鱼性别的方法，依次按照如下步骤进行：步骤1. 取马苏大麻哈鱼幼鱼，剪取其脂鳍，从脂鳍中提取DNA；步骤2. 以所提取的DNA为模板，以核苷酸序列如SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4、 SEQ ID NO：5和SEQ ID NO：6所示的三对引物进行PCR扩增反应，在PCR扩增反应体系中加入稀释10倍的10000
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SYBR green
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染料，所述PCR反应体系与10000
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SYBR green
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染料的体积比为25 ：1；步骤3. PCR扩增反应结束后，裸眼观察扩增产物颜色，颜色为黄绿色即为雄性个体，颜色为红橙色则为雌性个体。
[0006]优选的技术方案是所述PCR扩增反应体系总体积为25μL，其中模板DNA 5 ng、2
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reaction mix 12.5 μL，Bst DNA 聚合酶1 μL，核苷酸序列如SEQ ID NO：1及SEQ ID NO：2所示的引物各40 pmol，核苷酸序列如SEQ ID NO：3及SEQ ID NO：4所示的引物各35 pmol，核苷酸序列如SEQ ID NO：5及SEQ ID NO：6所示的引物各55 pmol，加dd H2O定容至25 μL；所述PCR扩增反应为63℃反应60分钟，每分钟一个循环；然后80℃反应5分钟，每分钟一个循环。
[0007]本专利技术是以马苏大麻哈鱼雄性特异标记OtY2基因组序列（GU181208）为目标产物而设计了三对PCR引物，灵敏度高、特异性好，只需1
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5ng/μL脂鳍DNA就能扩增得到目标产
物，进而可通过裸眼观察扩增产物颜色，即可精确鉴别出马苏大麻哈鱼幼鱼个体性别，对马苏大麻哈鱼幼鱼损伤较小，操作简便易行且应用成本较低，可在有限的养殖空间最大限度地饲养雌性个体，提高增殖放流数量。
具体实施方式
[0008]一种鉴别马苏大麻哈鱼幼鱼性别的方法，按照如下步骤进行：步骤1. 取马苏大麻哈鱼幼鱼，剪取其脂鳍，按照现有技术采用DNA试剂盒从脂鳍中提取马苏大麻哈鱼的DNA（每25mg组织中提取出8
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15μgDNA），可利用琼脂糖凝胶电泳检测提取的DNA质量（条带清晰即可），所有DNA样品立即进行步骤2或于
‑
80℃保存；步骤2. 以所提取的DNA为模板，以马苏大麻哈鱼雄性特异标记OtY2基因组序列（GU181208）为模板，以核苷酸序列如SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4、 SEQ ID NO：5和SEQ ID NO：6所示的三对引物进行PCR扩增反应，在PCR扩增反应体系中加入稀释10倍的10000
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SYBR green
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染料，所述PCR反应体系与10000
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染料的体积比为25 ：1；步骤3. PCR扩增反应结束后，裸眼观察扩增产物颜色，颜色由红橙色变为黄绿色即为雄性个体，颜色保持红橙色不变则为雌性个体。
[0009]所述PCR扩增反应体系总体积为25μL，其中模板DNA 5ng、2
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reaction mix 12.5 μL，Bst DNA 聚合酶1 μL，核苷酸序列如SEQ ID NO：1及SEQ ID NO：2所示的引物（第一对引物）各40 pmol，核苷酸序列如SEQ ID NO：3及SEQ ID NO：4所示的引物（第二对引物）各35 pmol，核苷酸序列如SEQ ID NO：5及SEQ ID NO：6所示的引物（第三对引物）各55 pmol，加dd H2O定容至25 μL；PCR反应在PCR仪中进行，所述PCR扩增反应条件如下：63℃反应60分钟，每分钟一个循环；然后80℃反应5分钟，每分钟一个循环。
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【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种鉴别马苏大麻哈鱼幼鱼性别的方法，其特征在于依次按照如下步骤进行：步骤1. 取马苏大麻哈鱼幼鱼，剪取其脂鳍，从脂鳍中提取DNA；步骤2. 以所提取的DNA为模板，以核苷酸序列如SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4、 SEQ ID NO：5和SEQ ID NO：6所示的三对引物进行PCR扩增反应，在PCR扩增反应体系中加入稀释10倍的10000
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染料，所述PCR反应体系与10000
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染料的体积比为25 ：1；步骤3. PCR扩增反应结束后，裸眼观察扩增产物颜色，...

【专利技术属性】
技术研发人员：殷旭旺，孙诗涵，梁珊，刘春晶，郑伟，刘钢，
申请(专利权)人：大连海洋大学，
类型：发明
国别省市：