一种电泳驱动制备发光传感膜及其用于脯肽酶的检测制造技术

本发明专利技术提供了一种电泳驱动制备发光传感膜及其用于脯肽酶的检测，首先在ITO电极上用溶胶

【技术实现步骤摘要】
一种电泳驱动制备发光传感膜及其用于脯肽酶的检测


[0001]本专利技术属于脯肽酶检测领域，具体涉及一种电化学发光传感膜的制备及脯肽酶的检测。

技术介绍

[0002]脯肽酶（PLD）是一种广泛存在于人体各组织的亚氨基肽酶，它能够催化含有碳末端脯氨酸二肽的水解，在细胞生长过程中脯氨酸的再循环具有重要作用。健康人群血清中脯肽酶的含量在1000 U/L左右，其水平变化与肝脏损害程度及慢性化肝病密切相关。因此，脯肽酶是肝脏疾病的重要诊断标准之一。目前，脯肽酶的主要检测方法为比色法，由脯肽酶酶解二肽底物释放的脯氨酸与茚三酮反应生成显色物质进行测定。但受到血浆中其它氨基酸和糖等基质的干扰（血浆中其它氨基酸、糖也可以与茚三酮发生化学反应），该方法存在检测结果不准确、灵敏度不高的问题。有研究报道使用毛细管电泳
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电化学发光联用技术可实现脯肽酶的灵敏检测。前端的毛细管电泳分离可以去除干扰基质；在检测池中，酶解产物脯氨酸能大大增强钌联吡啶（Ru(bpy)
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）发光试剂的电化学发光（ECL）信号，由此检测脯肽酶的活性。然而该方法需要使用数千伏的高压进行毛细管电泳分离操作，设备复杂、条件苛刻；在检测池的设计中，钌联吡啶发光试剂为非固定的流动相形式，易造成信号波动且损耗大、成本高。因此，发展一种准确性好、灵敏度高、操作简便的脯肽酶传感手段具有重要的应用价值。

技术实现思路

[0003]为解决上述难题，本专利技术制备了一种发光传感膜，可用于脯肽酶的电化学发光检测。首先在ITO电极上用溶胶r/>‑
凝胶生长法生长一层纳米均孔膜，它具有高度有序且垂直界面的纳米孔道结构。在ITO电极上施加负电位使得正电性的钌联吡啶发光试剂沉积到纳米孔道中，制备电化学发光传感膜。以甘氨酸
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脯氨酸二肽为酶解底物，脯肽酶催化酶解产生的游离脯氨酸含量与酶活性成正相关。游离的脯氨酸进入到传感膜的纳米孔道中与钌联吡啶作用产生电化学发光信号，根据信号强度的变化测定脯肽酶的活性。该专利技术解决了发光试剂的固定化问题，且无需复杂的样品前处理过程。
[0004]本专利技术采用如下技术方案：一种电泳驱动制备发光传感膜的方法，包括以下步骤：（1）溶胶
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凝胶生长法制备纳米均孔膜生长的氧化铟锡电极SIM/ITO：于15 mL乙醇和35 mL纯水的混合溶液中，加入0.08 g十六烷基三甲基溴化铵、0.04 mL硅酸四乙酯、5 μL浓氨水（25 wt%），配制成生长溶液，将清洗干净的ITO电极浸没于该生长溶液中，于60 ℃恒温水浴中生长24小时，随后取出电极并用大量的超纯水冲洗电极表面，置于100 ℃的烘箱中老化过夜，最后，将电极置于0.1 M的盐酸
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乙醇溶液中搅拌10 min、超纯水淋洗，得到SIM/ITO；（2）电泳制备钌联吡啶沉积纳米孔道的发光传感膜电极Ru(bpy)
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@SIM/ITO：配制
1 mM的三联吡啶氯化钌水溶液，用磷酸盐缓冲液（5 mM, pH=7）将其稀释至10 μM作为电泳底液；以SIM/ITO为工作电极，铂丝为对电极，Ag/AgCl为参比电极，采用计时电流法进行电泳操作，施加电位为
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1.0 V，时间为40 s；电泳完成后立即用超纯水冲洗工作电极，去除表面残余的Ru(bpy)
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溶液，即得到发光传感膜电极Ru(bpy)
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@SIM/ITO。
[0005]所述的发光传感膜用于脯肽酶检测的方法，包括以下步骤：（1）酶解反应过程：取100 μL的脯肽酶水溶液或血清样本，100 μL甘氨酰脯氨酸（10 mM）和10 μL 氯化锰水溶液（10 mM），790 μL磷酸盐缓冲液（100 mM,pH=8）于塑料离心管中涡旋混匀，于37 ℃孵育30 min进行酶解反应，随后在90 ℃水浴中放置10 min以终止反应，收集反应液用于电化学发光测定；（2）电化学发光测定过程：设置光电倍增管的工作电压为800 V；采用循环伏安法，设置扫描范围为0.6 ~ 1.3 V、扫速为0.1 V/s；将反应液置于石英皿中，以Ru(bpy)
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@SIM/ITO为工作电极，铂丝为对电极，Ag/AgCl为参比电极，进行电化学发光测试。
[0006] 二氧化硅纳米均孔膜（SIM）是一种纳米孔道高度有序且垂直界面的介孔薄膜材料。本专利技术首次利用电泳的方式将发光试剂沉积到均孔膜的纳米孔道内来制备固相发光传感膜，酶解产物脯氨酸进入纳米孔道并与钌联吡啶反应产生电化学发光信号，实现脯肽酶活性的定量分析。纳米均孔膜的孔道尺寸为2~3 nm，具有良好的抗基质干扰能力，避免了复杂的样品前处理过程；将发光试剂内置于纳米孔道中，可提高电化学发光反应效率、节约试剂。该方法具有操作简便、灵敏准确的特点。
[0007]本专利技术的优点在于：1. 采用电泳方法制备了Ru(bpy)
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@SIM/ITO传感器。以ITO电极为基底，通过溶胶
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凝胶生长法生长纳米均孔膜，再通过电泳的方式将钌联吡啶沉积到纳米孔道中，制备了Ru(bpy)
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@SIM/ITO传感器。电泳方法使纳米孔道中钌联吡啶的沉积量较多、不易泄露。对传感器制作过程的条件进行了优化，包括纳米均孔膜生长厚度（24 h）、电泳条件（
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1.0 V, 40 s）等。
[0008]2. 实现免样品预处理的脯肽酶高灵敏检测。Ru(bpy)
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@SIM/ITO传感器的电化学发光强度变化随脯肽酶活性的升高而增大，脯肽酶活性在10至10000 U/L的范围内，Ru(bpy)
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@SIM/ITO传感器的电化学发光强度与脯肽酶活性的对数值具有良好的线性关系，检测限为1.98 U/L。该方法具有良好的选择性和抗基质干扰能力。
[0009]3、利用电泳的方式将钌联吡啶发光试剂固载于均孔膜的纳米孔道当中，减少发光试剂的消耗且提高电化学发光的响应强度。
[0010]4、纳米均孔膜具有良好的抗基质干扰能力，因此无需复杂的样本前处理过程。无需毛细管电泳分离技术也能获得准确的检测结果，大大简化了测试条件和设备。
附图说明
[0011]图1为钌联吡啶沉积纳米孔道的发光传感膜电极制备流程；图2中（A）传感器的电化学发光信号随脯肽酶活性升高而增强的变化谱图。（B）传感器对一些干扰物质的电化学发光响应情况。
具体实施方式
[0012]为让本专利技术的上述特征和优点能更明显易懂，下文特举实施例，作详细说明。本专利技术的方法如无特殊说明，均为本领域常规方法。
[0013]实施例1一、发光传感膜的制备溶胶
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凝胶生长法制备纳米均孔膜生长的氧化铟锡电极（SIM/ITO）。于15 mL乙醇和35 mL纯水的混合溶液中，加入0.08 g十六烷基三甲基溴化铵、0.04 mL硅酸四乙酯、5 μL浓氨水（25 wt%），配制成生长溶液，本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种电泳驱动制备发光传感膜的方法，其特征在于，包括以下步骤：（1）制备二氧化硅纳米均孔膜生长的氧化铟锡电极SIM/ITO；（2）电泳制备钌联吡啶沉积纳米孔道的发光传感膜电极Ru(bpy)
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@SIM/ITO：用含有钌联吡啶的磷酸盐缓冲液作为电泳底液；以SIM/ITO为工作电极，铂丝为对电极，Ag/AgCl为参比电极，进行电泳操作；电泳后立即用超纯水冲洗工作电极，即得到发光传感膜电极Ru(bpy)
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@SIM/ITO。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，采用计时电流法进行电泳操作，施加电位为
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1.0 V，时间为40 s。3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，电泳底液为5 mM, pH=7的磷酸盐缓冲，其中含有10 μM的三联吡啶氯化钌。4.根据权利要求1
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3任一项所述的方法制得的发光传感膜。5.根据...

【专利技术属性】
技术研发人员：杨伟强，徐嘉靖，姚清达，倪建聪，
申请(专利权)人：闽南师范大学，
类型：发明
国别省市：