水稻抗稻瘟病基因LBRG2、重组载体、重组工程菌及基因LBRG2的功能鉴定方法技术

本发明专利技术提供了一种水稻抗稻瘟病新基因LBRG2、重组载体、重组工程菌及基因LBRG2的功能鉴定方法。该水稻抗稻瘟病新基因LBRG2具有如SEQ ID NO：1所述的编码区序列，如SEQ ID NO：2所述的氨基酸序列。该基因的CDS序列长1389bp，编码长462氨基酸的蛋白。该蛋白具有典型的NB

【技术实现步骤摘要】
水稻抗稻瘟病基因LBRG2、重组载体、重组工程菌及基因LBRG2的功能鉴定方法


[0001]本专利技术属于基因工程
，具体涉及一种水稻抗稻瘟病基因LBRG2、重组载体、重组工程菌及基因LBRG2的功能鉴定方法。

技术介绍

[0002]水稻(Oryza sativa L.)是世界主要的粮食作物之一，养活了世界半数以上的人口，尤其是对于中国这样的人口大国，水稻的高产、稳产尤为重要。水稻在整个生育期常常遭受毁灭性病原菌威胁，不仅降低了水稻产量种植，同时还增加了种植成本。
[0003]由稻瘟菌(Magnaporthe grisea)引起的稻瘟病被称为水稻“癌症”，几乎在水稻各生育期所有地上部器官均可发生，包括叶片、叶枕、节、茎秆、小穗，甚至可以侵染水稻根部，发病严重时可造成产量损失达80.0％，甚至绝收。目前，在大面积种植抗病品种的情况下，由稻瘟病引起的水稻年产量损失仍能占到世界水稻年产量损失的10.0～30.0％，全球每年因稻瘟病造成的产量损失足以养活6000万人口。随着世界人口的增加，对水稻需求的缺口也越来越大，有效防治水稻稻瘟病已逼在眉睫。常用的防治稻瘟病的方法主要有使用杀菌剂、采取农艺措施以及培育抗性品种。但是，过度使用杀虫剂来控制植物病害已经使全球环境受到严重污染，因此，选育和推广抗性品种成为防治水稻病害最经济、最安全、最有效的防治手段。然而稻瘟菌生理小种具有高变异性和快速进化性，水稻抗性品种往往在3～5年内就会失去其抗病优势，导致目前生产上所培育的抗病品种远达不到实际需要。因此，改善和增强水稻稻瘟病抗性、选育抗稻瘟病新品种，对保障国家粮食安全具有极为重要的意义。
[0004]目前，已有超过30个水稻抗稻瘟病基因被克隆，但多数抗性基因的抗谱较窄。因此，进一步挖掘水稻中的抗稻瘟病新基因，尤其是新的广谱抗病基因，可为通过抗性育种来绿色防控稻瘟病提供重要的基因资源。

技术实现思路

[0005]本专利技术的目的在于提供一种水稻抗稻瘟病新基因LBRG2、重组载体、重组工程菌及基因LBRG2的功能鉴定方法，以弥补现有水稻抗稻瘟病基因的不足，将其应用于水稻育种中提高水稻抗病性，尤其是水稻对稻瘟病的抗性，为通过抗性育种来绿色防控稻瘟病提供重要的基因资源。
[0006]为了解决上述技术问题，本专利技术采用的技术方案为：
[0007]本专利技术提出一种水稻抗稻瘟病基因LBRG2，所述LBRG2的编码区序列如SEQ ID NO.1所示，可应用于提高水稻稻瘟病抗性。
[0008]进一步的，所述水稻抗稻瘟病基因LBRG2编码的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。
[0009]本专利技术还提供了一种含有上述水稻抗稻瘟病新基因LBRG2的重组载体以及重组工程菌。
[0010]本专利技术还提供了一种上述水稻抗稻瘟病新基因LBRG2的功能鉴定方法，包括以下
步骤：
[0011]S1：将水稻抗稻瘟病新基因LBRG2克隆到pYLCRISPR/Cas9Pubi
‑
H载体中，得到表达载体；
[0012]S2：将表达载体用农杆菌转化法侵染水稻，得到基因敲除的突变体植株；
[0013]S3：将基因敲除的突变体植株的种子培养至三叶一心后，接种稻瘟菌的孢子悬液，培养7d后，观察、记录、分析叶片病斑面积。
[0014]进一步的，S1具体包括如下步骤：
[0015]参照测序的LBRG2的序列，并利用CRISPR
‑
P在线分析软件预测敲除靶点；
[0016]设计靶点引物后进行靶点接头的连接反应，将靶点接头与BsaI
‑
HF酶切后的sgRNA克隆载体通过两轮PCR构建sgRNA表达盒；
[0017]将两个所述sgRNA表达盒与BsaI
‑
HF酶切后pYLCRISPR/Cas9Pubi
‑
H载体进行infusion连接反应，构pYLCRISPR/Cas9Pubi
‑
H
‑
LBRG2表达载体并转化大肠杆菌DH5α。
[0018]进一步的，所述sgRNA克隆载体包括pYLgRNA
‑
OsU6a/LacZ和pYLgRNA
‑
OsU6b。
[0019]进一步的，所述靶点引物包括：
[0020]LBRG2
‑
T1
‑
F，其序列如SEQ ID NO.3所示，LBRG2
‑
T1
‑
R，其序列如SEQ ID NO.4所示；
[0021]LBRG2
‑
T2
‑
F，其序列如SEQ ID NO.5所示，LBRG2
‑
T2
‑
R其序列如SEQ ID NO.6所示。
[0022]进一步的，S2之后还包括对基因敲除的突变体植株的DNA进行分子鉴定；
[0023]分子鉴定方法，具体包括以下步骤：
[0024]设计潮霉素引物hygF和hygR，并对所述基因敲除的突变体植株的潮霉素基因的一段进行扩增，扩增出1035bp大小片段为阳性植株；
[0025]收集阳性植株的种子，播种后取幼叶提取DNA进行靶位点的突变检测；
[0026]设计包含靶位点片段PCR的引物LBRG2
‑
TC
‑
F、LBRG2
‑
TC
‑
R，扩增出489bp大小的片段进行测序分析，测序结果为移码突变的植株即为纯合敲除植株，后代即为纯合Cas9敲除突变体植株；
[0027]所述hygF的序列如SEQ ID NO.7所示，hygR的序列如SEQ ID NO.8所示；所述LBRG2
‑
TC
‑
F的序列如SEQ ID NO.9所示，LBRG2
‑
TC
‑
R的序列如SEQ ID NO.10所示。
[0028]进一步的，S3中接种稻瘟菌的孢子悬液，培养7d后，观察、记录、分析叶片病斑面积，的具体步骤为：
[0029]采用高压雾化器喷雾接种1.0
×
105～2.0
×
105个/mL的稻瘟菌的孢子悬液，在接种室培养7d，然后观察叶片病斑(以第二片幼叶为准)，拍照记录，并用ImageJ软件分析病斑面积。
[0030]专利技术的有益效果在于：
[0031]本专利技术的水稻抗稻瘟病新基因LBRG2是首次从水稻中克隆得到的，其CDS长1389bp，编码462氨基酸的蛋白。用CDD在线程序分析预测可知，该蛋白具有典型的NB
‑
ARC结构域。通过比较水稻Cas9敲除突变体和野生型水稻对稻瘟菌的耐受性，发现LBRG2基因可以提高水稻的抗稻瘟病能力。将其应用于基因工程领域具有重要的经济价值和应用前景。
附图说明
[0032]图1为本专利技术实施例1的LBRG2的PCR产物在琼本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种水稻抗稻瘟病基因LBRG2，其特征在于，所述LBRG2的编码区序列如SEQ ID NO.1所示。2.如权利要求1所述的水稻抗稻瘟病新基因LBRG2，其特征在于，其编码的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。3.一种含有如权利要求1所述的水稻抗稻瘟病新基因LBRG2的重组载体。4.一种含有如权利要求1所述的水稻抗稻瘟病新基因LBRG2的重组工程菌。5.一种如权利要求1所述的水稻抗稻瘟病新基因LBRG2的功能鉴定方法，其特征在于，包括以下步骤：S1：将水稻抗稻瘟病新基因LBRG2克隆到pYLCRISPR/Cas9Pubi
‑
H载体中，得到表达载体；S2：将表达载体用农杆菌转化法侵染水稻，得到基因敲除的突变体植株；S3：将基因敲除的突变体植株的种子培养至三叶一心后，接种稻瘟菌的孢子悬液，培养7d后，观察、记录、分析叶片病斑面积。6.如权利要求5所述的水稻抗稻瘟病新基因LBRG2的功能鉴定方法，其特征在于，S1具体包括如下步骤：参照测序的LBRG2的序列，并利用CRISPR
‑
P在线分析软件预测敲除靶点；设计靶点引物后进行靶点接头的连接反应，将靶点接头与BsaI
‑
HF酶切后的sgRNA克隆载体通过两轮PCR构建sgRNA表达盒；将两个所述sgRNA表达盒与Bsa I
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HF酶切后pYLCRISPR/Cas9Pubi
‑
H载体进行infusion连接反应，构pYLCRISPR/Cas9Pubi
‑
H
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LBRG2表达载体并转化大肠杆菌DH5α。7.如权利要求6所述的水稻抗稻瘟病新基因LBRG2的功能鉴定方法，其特征在于，所述sgRNA克隆载体包括pYLgRNA
‑
OsU6a/LacZ和pYLgRNA
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OsU6b。8.如权利要求6所述的水稻抗稻瘟病新基因LBRG2的功能鉴定方法，其特征在于，所述靶点引物包括：LBRG2
‑
T1<...

【专利技术属性】
技术研发人员：何华勤，冯常青，马世伟，
申请(专利权)人：福建农林大学，
类型：发明
国别省市：