基于二代测序的血液病检测方法及试剂盒技术

本发明专利技术提出了一种基于二代测序的血液病检测方法及试剂盒，利用基因探针杂交法富集129个基因的全部外显子区域，提高了检测灵敏度及检测范围。进一步将基因筛选列表做成探针，通过杂交捕获测序针对性地检测高危基因，可以更高效地检测出对诊断、治疗有指导意义的基因突变，有助于临床医生的诊断，针对性制定治疗方案。治疗方案。

【技术实现步骤摘要】
基于二代测序的血液病检测方法及试剂盒


[0001]本专利技术属于泛癌多基因检测
，具体地，涉及基于二代测序的血液病检测方法及试剂盒，更具体地，涉及一种基因标志物组合、试剂盒、试剂盒在检测血液病中的用途以及血液病预后评估的系统。

技术介绍

[0002]血液病被称为造血系统疾病，包括原发于造血系统疾病(如原发于骨髓组织等)和主要累及造血红细胞系统疾病(如缺铁性贫血等)。血液病的种类繁多，临床上可分为良性血液病和恶性血液病。常见的血液疾病一般有出血性疾病(如血小板减少、血友病等)、红细胞疾病(如地中海贫血、再生障碍性贫血等)、白细胞疾病(如白血病、多发性骨髓瘤等)和骨髓增生型疾病(如真性红细胞增多症、骨髓纤维化、原发性血小板增多症等)。在西方国家中急性白血病、恶性淋巴瘤、多发性骨髓瘤等血液系统恶性肿瘤均位于恶性肿瘤发病的前十位，在我国发病率也呈现逐年上升的趋势。在恶性肿瘤所致的死亡率中，白血病居第六位(男性)和第八位(女性)。但在儿童及35岁以下成年人中居第一位。血液肿瘤是一种具有高度异质性的疾病，其诊疗需要结合形态学、免疫学、遗传学和分子生物学进行综合分析。随着技术的发展，人们已经逐渐认识到血液病的发生往往是多基因共同变异的结果，并通过测序，PCR等基因检测技术对骨髓组织进行基因突变检测，有助于了解疾病的产生、发展过程，判断疾病的类型和预后；并且致病基因的研究带动了靶向药物的研究，越来越多的靶向药物已经运用在了病人的治疗上。
[0003]目前用于临床的血液病基因突变检测技术主要有一代测序技术，二代测序技术，数字PCR技术。一代测序技术利用在DNA合成反应体系中，混入一定比例带有同位素标记的双脱氧核苷三磷酸(ddNTP)，使DNA合成延伸终止在不同的核苷酸上，通过变性聚丙烯酰氨凝胶电泳分离和显影获得待测DNA的碱基序列。一代测序虽然准确度十分高，且该技术在当下依然被广泛应用，但是通量太低。dPCR技术将一个样本分成几到几十万份，分配到不同的反应单元，每个单元包含一个或多个拷贝的目标分子(DNA模板)，在每个反应单元中分别对目标分子进行PCR扩增；扩增结束后，将有荧光信号和没有荧光信号的微滴进行判读。该技术的优点是可以实现绝对定量，有更高的敏感性和特异性，但同时也有缺点：一方面只能检测已知的有针对性的突变，不能检测未知突变；另一方面由于仪器设备和试剂昂贵，操作复杂，检测时间长且检测范围较窄。
[0004]二代测序技术(Second Generation Sequencing，SGS)又称为下一代测序技术(Next Generation Sequencing，NGS)，近年来，二代测序技术已经应用于血液肿瘤相关突变研究。相比于一代测序技术，二代测序技术在基因突变的分析中通量更高，单个位点成本较低，相比一代测序大幅降低了成本，并且大幅降低了测序时间，同时也保持了较高的灵敏度，对于多基因分析及突变检测具有独特的优势。随着疾病研究的不断进行，被发现的疾病相关基因越来越多，突变类型也越来越多，一代测序也已经远远不能满足我们的测序要求。为推动NGS在血液肿瘤诊疗中的应用，提高诊疗水平，中国抗癌协会血液肿瘤专业委员会、
中华医学会血液学分会、中华医学会病理学分会组织国内的血液、病理和检验专家，结合国外权威资料和已积累的大样本数据，制定了NGS在血液肿瘤中应用的中国专家共识。依据该专家共识，二代测序在血液肿瘤诊疗中发挥着：诊断分型，预后判定，指导治疗，MRD监测等应用价值。为了能够辅助血液病的临床诊断以及预后，本领域亟需开发一种基于二代测序的血液病相关基因检测试剂盒。

技术实现思路

[0005]本申请是基于专利技术人对以下问题的发现和认识作出的：
[0006]在本专利技术的第一方面，本专利技术提出了一种基因标志物组合。根据本专利技术的实施例，包括以下基因：ABCB1、CBL、DDX41、FAT3、JAK1、MYD88、PIK3CD、SAMD9L、TET2、ABL1、CCND1、DHX15、FBXW7、JAK2、NF1、PLCG2、SETBP1、TNFAIP3、ANKRD26、CCND2、DKC1、FGFR1、JAK3、NFKBIE、PML、SETD2、TP53、ASXL1、CD79B、DNM2、FLT3、KDM6A、NOTCH1、PPM1D、SF1、TPMT、ASXL2、CDKN2A、DNMT3A、GATA1、KIT、NOTCH2、PRPF8、SF3B1、TTN、ATG2B、CDKN2B、EBF1、GATA2、KMT2A、NPM1、PTEN、SH2B3、U2AF1、ATRX、CEBPA、EGR2、GATA3、KMT2C、NQO1、PTPN11、SMC1A、WT1、BCL2、CREBBP、ELANE、GFI1、KMT2D、NRAS、RAD21、SMC3、ZBTB7A、BCOR、CRLF2、EP300、GSKIP、KRAS、NT5C2、RARα、SRP72、ZRSR2、BCORL1、CSF1R、EPOR、GSTP1、MBD4、PAX5、RB1、SRSF2、BIRC3、CSF3R、ERG、HAX1、MECOM、PDGFRA、RHOA、STAG2、BRAF、CUX1、ETNK1、IDH1、MEF2B、PDGFRB、ROBO1、STAT3、BTK、CXCR4、ETV6、IDH2、MPL、PHF6、ROBO2、STAT5B、CALR、CYP2C19、EZH2、IKZF1、MTHFR、PIGA、RUNX1、TERC、CARD11、CYP3A5、FAT1、IL7R、MTOR、PIK3CA、SAMD9和TERT。
[0007]根据本专利技术的实施例，所述基因标志物组合用于检测与血液病相关的基因突变。利用本申请所述的基因标志物组合一方面扩大了检测灵敏度以及检测范围，提高了检测的准确性。另一方面，还可以预测血液病的发生风险，有助于临床医生进行准确判断、发病前采取预防措施以及患病后个体化治疗以及制定治疗方案等。
[0008]需要说明的是，本申请所述的用于对血液病进行检测的129个基因包括外显子编码区以及内含子区。
[0009]根据本专利技术的实施例，上述基因标志物组合还可以进一步包括如下技术特征至少之一：
[0010]根据本专利技术的实施例，所述基因包括下列突变的至少之一：点突变、缺失突变、插入突变。所述突变包括全部外显子区域。专利技术人发现通过检测129个基因的全部外显子区域与内含子区域增加了检测灵敏度及检测范围。
[0011]在本专利技术的第二方面，本专利技术提出了一种试剂盒。根据本专利技术的实施例，所述试剂盒包括用于检测本专利技术第一方面所述的基因标志物组合的试剂。
[0012]根据本专利技术的实施例，含有基因标志物组合的试剂构成的试剂盒可以对血液病进行快速的初步检测或预后判断。本申请所述的基于129个血液病基因标志物的检测试剂盒具有更高的灵敏度和特异性。通过分析多个基因标志物，可以在早期诊断的阶段发现风险较高的个体，从而采取有效的预防措施。此外，基于基因标志物的试剂盒还可以用于筛查和监测血液病，以及评估治疗效果和血液病复发的风险等方面。作为一本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种基因标志物组合，其特征在于，包括以下基因：ABCB1、CBL、DDX41、FAT3、JAK1、MYD88、PIK3CD、SAMD9L、TET2、ABL1、CCND1、DHX15、FBXW7、JAK2、NF1、PLCG2、SETBP1、TNFAIP3、ANKRD26、CCND2、DKC1、FGFR1、JAK3、NFKBIE、PML、SETD2、TP53、ASXL1、CD79B、DNM2、FLT3、KDM6A、NOTCH1、PPM1D、SF1、TPMT、ASXL2、CDKN2A、DNMT3A、GATA1、KIT、NOTCH2、PRPF8、SF3B1、TTN、ATG2B、CDKN2B、EBF1、GATA2、KMT2A、NPM1、PTEN、SH2B3、U2AF1、ATRX、CEBPA、EGR2、GATA3、KMT2C、NQO1、PTPN11、SMC1A、WT1、BCL2、CREBBP、ELANE、GFI1、KMT2D、NRAS、RAD21、SMC3、ZBTB7A、BCOR、CRLF2、EP300、GSKIP、KRAS、NT5C2、RARα、SRP72、ZRSR2、BCORL1、CSF1R、EPOR、GSTP1、MBD4、PAX5、RB1、SRSF2、BIRC3、CSF3R、ERG、HAX1、MECOM、PDGFRA、RHOA、STAG2、BRAF、CUX1、ETNK1、IDH1、MEF2B、PDGFRB、ROBO1、STAT3、BTK、CXCR4、ETV6、IDH2、MPL、PHF6、ROBO2、STAT5B、CALR、CYP2C19、EZH2、IKZF1、MTHFR、PIGA、RUNX1、TERC、CARD11、CYP3A5、FAT1、IL7R、MTOR、PIK3CA、SAMD9和TERT中的至少之一。2.根据权利要求1所述的基因标志物组合，其特征在于，所述基因包括下列突变的至少之一：点突变、缺失突变或插入突变；所述突变包括全部外显子区域。3.一种试剂盒，其特征在于，包括用于检测权利要求1或2所述的基因标志物组合的试剂。4.根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂包括引物、探针、抗体或荧光试剂。5.根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，进一步包括下列中的至少之一：DNA提取试剂、建库试剂、Panel测序试剂和高通量测序试剂。6.根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，进一步包括权利要求1～2任一项所述的基因标志物组合的参考数据集。7.权利要求3～6任一项所述的试剂盒在检测血液病、评估血液病预后效果或用药指导中的用途。8.根据权利要求7所述的用途，其特征在于，所述血液病包括下列中的至少之一：骨髓增生异常综合征、骨髓增生性肿瘤、急性髓系白血病、B细胞淋巴瘤、慢性嗜酸性白血病、血小板减少、血友病、地中海贫血、再生障碍性贫血、白血病、多发性骨髓瘤、真性红细胞增多症、骨髓纤维化、原发性血小板增多症。9.根据权利要求7所述的用途，其特征在于，所述检测或评估是通过二代测序技术实现的。10.根据权利要求7所述的用途，其特征在于，下列基因标志物突变用于检测骨髓增生异常综合征或评估骨髓增生异常综合征的预后效果；RUNX1、SF3B1、ASXL1、U2AF1、ANKRD26、ETV6、JAK2、SETBP1、TERC、EZH2、NPM1、SETD2、TERT、BCOR、FLT3、NRAS、TET2、CBL、GATA1、PHF6、SRP72、TP53、CUX1、GATA2、SRSF2、DDX41、IDH1、SAMD9、STAG2、WT1、DNMT3A、IDH2、SAMD9L、STAT3和ZRSR2。11.根据权利要求10所述的用途，其特征在于，选自RUNX1、SF3B1、ASXL1、U2AF1中至少之一的突变和选自ANKRD26、ETV6、JAK2、SETBP1、TERC、EZH2、NPM1、SETD2、TERT、...

【专利技术属性】
技术研发人员：朱丹丹，占闽宁，李京帅，耿帅鹏，
申请(专利权)人：郑州思勤生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：