一种N-乙酰-D-氨基酸、D-氨基酸、D-氨基酸衍生物的制备方法技术

本发明专利技术涉及基因工程及发酵工程技术领域，具体公开了一种N

【技术实现步骤摘要】
一种N
‑
乙酰
‑
D
‑
氨基酸、D
‑
氨基酸、D
‑
氨基酸衍生物的制备方法


[0001]本专利技术涉及基因工程及发酵工程
，具体涉及一种N
‑
乙酰
‑
D
‑
氨基酸、D
‑
氨基酸、D
‑
氨基酸衍生物的制备方法。

技术介绍

[0002]氨基酸有D
‑
氨基酸和L
‑
氨基酸两种异构体，它们在生物体内发挥着不同的生理功能。过量的D
‑
氨基酸会抑制细胞生长，并且含D
‑
氨基酸的多肽通常不被或缓慢地被肽酶水解，然而D
‑
氨基酸用于合成β
‑
内酰胺类抗生素和生理活性肽上具有较好的表现，如D
‑
缬氨酸合成的缬氨酸杀虫菊酯I与L
‑
氨基酸合成的菊酯杀虫剂相比，前者活性高出5000倍。再比如含一个D
‑
丙氨酸的甜味剂天丙二肽甜度高、热量低，更适合于糖尿病、肥胖症等病人食用。
[0003]近年来D
‑
氨基酸在医药、农药和食品等领域中的用途正在被广泛而迅速地挖掘。各个领域对D
‑
氨基酸的需求快速增长的势头，然而现有技术中，D
‑
氨基酸生产具有高单价、低产率、个异化的特点，因此迫切需要一种高效、通用的制备方法满足实际需求。D
‑/>氨基酸目前的生产方法包括化学拆分、化学合成、生物发酵以及酶法等，但是都是针对特定氨基酸合成所制定的特定策略，不同类型的D
‑
氨基酸的生产工艺开发成本较高，开发的工艺获利单一，亟待改进。
[0004]N
‑
乙酰
‑
D
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氨基酸作为D
‑
氨基酸生产极为重要的中间体，同样存在高单价、低产率、个异化的特点，同样迫切需要一种高效、通用的制备方法满足实际需求。
[0005]因此，本专利技术旨在建立一个通用的以L
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氨基酸或D,L
‑
氨基酸(即D
‑
氨基酸与L
‑
氨基酸的混合物)或二者的混合为原料，大量制备N
‑
乙酰
‑
D
‑
氨基酸的方法，N
‑
乙酰
‑
D
‑
氨基酸进一步应用于D
‑
氨基酸及氨基酸衍生物的制备。

技术实现思路

[0006]本专利技术所解决的技术问题在于提供一种通用的以L
‑
氨基酸或D,L
‑
氨基酸为原料或二者的混合为原料，适合工业化加工，从而大量制备N
‑
乙酰
‑
D
‑
氨基酸的方法。
[0007]本专利技术所解决的技术问题之二在于提供一种通用的以L
‑
氨基酸或D,L
‑
氨基酸为原料或二者的混合为原料，适合工业化加工，从而大量制备D
‑
氨基酸的方法。
[0008]本专利技术所解决的技术问题之三在于提供一种通用的以L
‑
氨基酸或D,L
‑
氨基酸为原料或二者的混合为原料，适合工业化加工，从而大量制备D
‑
氨基酸衍生物的方法。
[0009]本专利技术所解决的技术问题之四在于提高N
‑
乙酰
‑
D
‑
氨基酸或D
‑
氨基酸或D
‑
氨基酸衍生物的方法。
[0010]本专利技术所解决的技术问题采用以下技术方案来实现：
[0011]一种N
‑
乙酰
‑
D
‑
氨基酸的制备方法，以L
‑
氨基酸和/或D,L
‑
氨基酸为原料，L
‑
氨基酸在L
‑
氨基酸异构酶的作用下转化为D
‑
氨基酸，D
‑
氨基酸在酰基转移酶的作用下转化为N
‑
乙酰
‑
D
‑
氨基酸。
[0012]进一步地，转化在细菌或真菌体内完成或将L
‑
氨基酸异构酶、酰基转移酶提取后在体外完成。
[0013]进一步地，以L
‑
氨基酸和/或D,L
‑
氨基酸为原料为底物，加入含有L
‑
氨基酸异构酶编码基因及酰基转移酶编码基因的重组微生物进行发酵培养，发酵过程中，重组微生物过表达产生所述L
‑
氨基酸异构酶及酰基转移酶。
[0014]进一步地，L
‑
氨基酸异构酶编码基因包括ILEP、dadX、murI、ygeA或alr中的一种或几种，酰基转移酶编码基因包括Hpa3、Hpa2中的一种或两种。
[0015]进一步地，包括通过基因工程方法构建所述重组微生物，基因工程方法包括质粒表达或基因组整合。
[0016]进一步地，重组微生物通过质粒表达的方法进行构建，构建方法为：通过PCR扩增获得L
‑
氨基酸异构酶编码基因及酰基转移酶编码基因，将获得的基因共同连接至含有IPTG诱导型启动子的质粒载体上并转化至感受态细胞中，测序后获得重组载体；将重组载体转化至受体微生物中即得到重组微生物。
[0017]优选的，质粒载体为pZAlac、pZElac中的一种或两种。
[0018]进一步地，重组载体包括pZE
‑
ILEP和pZE
‑
Hpa3。
[0019]进一步地，微生物选自大肠杆菌、芽孢杆菌、棒状杆菌、酵母或链霉菌中的一种或几种。
[0020]进一步地，微生物选自大肠埃希氏菌(Escherichia coli)、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)、巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)、解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)、谷氨酸棒状杆菌(Corynebacterium glutamicum)、酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、产朊假丝酵母(Candida utilis)或毕赤酵母(Pichia pastoris)中的一种或几种。
[0021]进一步地，发酵过程中，发酵温度为20～40℃，转速为180
‑
240rpm。
[0022]优选的，所述发酵温度为30
‑
35℃。
[0023]优选为30℃。优选为32℃。优选为35℃。
[0024]优选的，转速为220rpm。
[0025]进一步地，发酵时，采用的培养基包括如下比例的本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种N
‑
乙酰
‑
D
‑
氨基酸的制备方法，其特征在于，以L
‑
氨基酸和/或D,L
‑
氨基酸为原料，L
‑
氨基酸在L
‑
氨基酸异构酶的作用下转化为D
‑
氨基酸，D
‑
氨基酸在酰基转移酶的作用下转化为N
‑
乙酰
‑
D
‑
氨基酸。2.根据权利要求1所述的N
‑
乙酰
‑
D
‑
氨基酸的制备方法，其特征在于，转化在细菌或真菌体内完成或将L
‑
氨基酸异构酶、酰基转移酶提取后在体外完成。3.根据权利要求1所述的N
‑
乙酰
‑
D
‑
氨基酸的制备方法，其特征在于，以L
‑
氨基酸和/或D,L
‑
氨基酸为底物，加入含有L
‑
氨基酸异构酶编码基因及酰基转移酶编码基因的重组微生物进行发酵培养，发酵过程中，重组微生物过表达产生所述L
‑
氨基酸异构酶及酰基转移酶。4.根据权利要求3所述的N
‑
乙酰
‑
D
‑
氨基酸的制备方法，其特征在于，L
‑
氨基酸异构酶编码基因包括ILEP、dadX、murI、ygeA或alr中的一种或几种，酰基转移酶编码基因包括Hpa3、Hpa2中的一种或两种。5.根据权利要求3所述的N
‑
乙酰
‑
D
‑
氨基酸的制备方法，其特征在于，包括通过基因工程方法构建所述重组微生物，基因工程方法包括质粒表达或基因组整合。6.根据权利要求5所述的N
‑
乙酰
‑
D
‑
氨基酸的制备方法，其特征在于，重组微生物通过质粒表达的方法进行构建，构建方法为：通过PCR扩增获得L
‑
氨基酸异构酶编码基因及酰基转移酶编码基因，将获得的基因共同连接至含有IPTG诱导型启动子的质粒载体上并转化至感受态细胞中，测序后获得重组载体；将重组载体转化至受体微生物中即得到重组微生物。7.根据权利要求6所述的N
‑
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【专利技术属性】
技术研发人员：毕严麒，张科春，
申请(专利权)人：元素驱动杭州生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：