体外系统性评估屎肠球菌的方法技术方案

本发明专利技术提供体外系统性评估屎肠球菌的方法，方法步骤包括：向装灭菌动物饲料的透明容器中加入模拟胃液，再加入灭菌石蜡形成厌氧培养体系，设置加有生理盐水的试验组S1、S2，再设置分别补加有屎肠球菌样品稀释液的试验组S3、S4；向S1、S2、S3、S4的胃消化液的灭菌石蜡液面以下加入模拟肠液和含牛胆碱的磷酸缓冲液，另向S2、S4补加动物粪便菌群悬液，振荡培养；对比S1，测试统计试验组S3的肠道消化液的外观变化、pH值变化、OD

【技术实现步骤摘要】
体外系统性评估屎肠球菌的方法


[0001]本专利技术涉及微生物
，具体涉及一种体外系统性评估屎肠球菌的方法。

技术介绍

[0002]屎肠球菌是一种可以定植在动物肠道内的益生菌，属于需氧或者兼性厌氧菌，通常定植在宿主的回肠和结肠部位，且生长速度快。屎肠球菌已被农业农村部第318号公告列为十五种可直接饲喂的饲料级微生物菌种之一。
[0003]目前，对屎肠球菌的性能评估多集中于耐酸、耐胆盐、耐消化酶等指标，但是常规评估方法利用发酵培养基进行评估，无法真实反映屎肠球菌在动物肠道中的生长代谢情况和对肠道菌群的影响。

技术实现思路

[0004]基于此，有必要提供一种体外系统性评估屎肠球菌的方法，能够相对较为真实地评估屎肠球菌的生长代谢能力和对肠道菌群的影响效果。
[0005]本专利技术采用如下技术方案：
[0006]本专利技术提供一种体外系统性评估屎肠球菌的方法，包括如下步骤：
[0007]分别制备屎肠球菌样品稀释液和灭菌动物饲料；
[0008]模拟胃消化：向装灭菌动物饲料的透明容器中加入pH为2.0的模拟胃液和生理盐水，所述模拟胃液含胃蛋白酶，再加入灭菌石蜡形成厌氧培养体系，平行重复，分别记为试验组S1、S2；向装灭菌动物饲料的透明容器中加入模拟胃液和屎肠球菌样品稀释液，再加入灭菌石蜡形成厌氧培养体系，平行重复，分别记为试验组S3、S4；分别将试验组S1、S2、S3、S4的样品置于37～45℃恒温水浴摇床中振荡培养，得胃消化液；
[0009]模拟肠道消化：向试验组S1、S3的胃消化液的灭菌石蜡液面以下加入模拟肠液和含牛胆碱的磷酸缓冲液，所述模拟肠液含胰蛋白酶、糜蛋白酶和淀粉酶，控制混合液pH值为6.4～6.6，于37～45℃恒温水浴摇床中振荡培养；向试验组S2、S4的胃消化液的石蜡液面以下加入模拟肠液、磷酸缓冲液和动物粪便菌群悬液，控制混合液pH值为6.4～6.6，于37～45℃恒温水浴摇床中振荡培养；
[0010]系统评估：
[0011]对比试验组S1，测试统计试验组S3的肠道消化液的外观变化、pH值变化、OD
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变化以及有机酸含量变化，评估屎肠球菌的耐酸性能、耐酶性能、耐胆盐性能以及生长代谢情况；对比试验组S2，测试统计试验组S4的肠道消化液中大肠杆菌和沙门氏菌的数量，评估屎肠球菌对其他菌群的影响。
[0012]在其中一些实施例中，所述动物饲料选自肉鸡饲料，组成包括58％～65％玉米，25％～35％豆粕以及少量豆油和肉鸡预混料。
[0013]在其中一些实施例中，在试验组S1、S2中，灭菌动物饲料与模拟胃液和生理盐水的质量体积比为1g:10mL:0.1mL；在试验组S3、S4中，灭菌动物饲料与模拟胃液和屎肠球菌样
品稀释液的质量体积比为1g:10mL:0.1mL，屎肠球菌的添加量为0.01亿/g动物饲料。
[0014]在其中一些实施例中，在试验组S1、S2中，灭菌动物饲料与模拟肠液和含牛胆碱的磷酸缓冲液的质量体积比为1g:2mL:8mL；在试验组S3、S4中，灭菌动物饲料与模拟肠液、含牛胆碱的磷酸缓冲液和粪便菌群悬液的质量体积比为1g:2mL:8mL:2mL，牛胆碱在模拟消化体系中的浓度为0.03％。
[0015]在其中一些实施例中，所述模拟胃液的制备步骤为：每10mL pH为2.0的HCL溶液中溶解4.43mg胃蛋白酶(酶活700U/mg)。
[0016]在其中一些实施例中，所述模拟肠液的制备步骤为：每2mL去离子水中，溶解9.57mg胰蛋白酶(酶活100U/mg)、5.28mg糜蛋白酶(酶活40U/mg)和0.39mL淀粉酶(酶活20000U/mL)。
[0017]在其中一些实施例中，所述牛胆碱的磷酸缓冲液的制备步骤为：每100mL去离子水中，溶解0.75g牛胆碱、0.4675g无水磷酸氢二钠、2.0045g无水磷酸二氢钠、0.5565g氯化钠和0.1545g氯化钾，采用氢氧化钠调节溶液pH至6.60。
[0018]在其中一些实施例中，所述灭菌动物饲料的制备步骤为：称取动物饲料样品置于玻璃管中，塞上瓶盖，于121℃高压灭菌锅中灭菌30min，灭菌后置于烘箱中烘干样品，冷却后备用。
[0019]在其中一些实施例中，所述屎肠球菌样品稀释液的制备步骤为：称取1g活菌数2000亿/g的屎肠球菌样品，加入99mL已灭菌的0.85％生理盐水中，用棉塞密封后包上牛皮纸，置于摇床中，于室温下振荡提取30min；再取以上提取的菌混悬液，逐级稀释200倍，至菌液终浓度为0.1亿/mL，得屎肠球菌样品稀释液。
[0020]与现有技术相比，本专利技术的核心优势在于：
[0021]1)本专利技术体外系统性评估屎肠球菌的方法，利用动物饲料和石蜡密封条件模拟胃肠道消化环境中的pH值、消化酶环境和缓冲盐体系等可以将胃和肠道消化过程联动起来，不仅可用于直接一套流程评估筛选可耐酸、耐酶、耐胆盐的屎肠球菌，还可系统性评估屎肠球菌在模拟消化环境中的生长代谢情况及对其他菌群生长的影响效果。
[0022]2)本专利技术方法采用动物饲料和消化酶复配系替代常规培养基，为屎肠球菌提供了营养生长条件，贴近动物实际饲养环境中的营养供给，可最大真实程度地模拟屎肠球菌在动物消化道营养环境中的生长代谢情况。
附图说明
[0023]图1为实施例1中试验组一和试验三中肠道消化液产物的外观图片。
具体实施方式
[0024]下面结合具体实施例对本专利技术作进一步的详细说明，以使本领域的技术人员更加清楚地理解本专利技术。以下各实施例，仅用于说明本专利技术，但不止用来限制本专利技术的范围。基于本专利技术中的具体实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动的情况下，所获得的其他所有实施例，都属于本专利技术的保护范围。在本专利技术实施例中，若无特殊说明，所有原料组分均为本领域技术人员熟知的市售产品；在本专利技术实施例中，若未具体指明，所用的技术手段均为本领域技术人员所熟知的常规手段。
[0025]关键试验材料：
[0026]屎肠球菌：市售屎肠球菌产品。
[0027]肉鸡饲料：市售，包含62％玉米、33％豆粕、2.5％豆油、2.5％肉鸡预混料。
[0028]模拟肠液的配制方法为：纯水中，加9.57mg胰蛋白酶(酶活100U/mg)、5.28糜蛋白酶(酶活40U/mg)和0.39mL淀粉酶(酶活20000U/mg)。
[0029]磷酸盐缓冲液的配制方法为：称取0.75g牛胆碱、0.4675g无水磷酸氢二钠、2.0045g无水磷酸二氢钠、0.5565g氯化钠和0.1545g氯化钾于烧杯中，加入100mL去离子水溶解，用氢氧化钠调节溶液pH至6.60。其中，牛胆碱在模拟消化体系中的浓度为0.03％。
[0030]粪便菌群悬液的配制方法为：取适量肉鸡粪便样品(具体来源：粪便从常规肉鸡养殖实验中收集，肉鸡饲喂常规肉鸡料，不含抗生素或其他功能性添加剂)，加入0.85％生理盐水，以1：50(m/V)混合稀释，涡旋本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种体外系统性评估屎肠球菌的方法，其特征在于，包括如下步骤：分别制备屎肠球菌样品稀释液和灭菌动物饲料；模拟胃消化：向装灭菌动物饲料的透明容器中加入pH为2.0的模拟胃液和生理盐水，所述模拟胃液含胃蛋白酶，再加入灭菌石蜡形成厌氧培养体系，平行重复，分别记为试验组S1、S2；向装灭菌动物饲料的透明容器中加入模拟胃液和屎肠球菌样品稀释液，再加入灭菌石蜡形成厌氧培养体系，平行重复，分别记为试验组S3、S4；分别将试验组S1、S2、S3、S4的样品置于37～45℃恒温水浴摇床中振荡培养，得胃消化液；模拟肠道消化：向试验组S1、S3的胃消化液的灭菌石蜡液面以下加入模拟肠液和含牛胆碱的磷酸缓冲液，所述模拟肠液含胰蛋白酶、糜蛋白酶和淀粉酶，控制混合液pH值为6.4～6.6，于37～45℃恒温水浴摇床中振荡培养；向试验组S2、S4的胃消化液的石蜡液面以下加入模拟肠液、磷酸缓冲液和动物粪便菌群悬液，控制混合液pH值为6.4～6.6，于37～45℃恒温水浴摇床中振荡培养；系统评估：对比试验组S1，测试统计试验组S3的肠道消化液的外观变化、pH值变化、OD
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变化以及有机酸含量变化，评估屎肠球菌的耐酸性能、耐酶性能、耐胆盐性能以及生长代谢情况；对比试验组S2，测试统计试验组S4的肠道消化液中大肠杆菌和沙门氏菌的数量，评估屎肠球菌对其他菌群的影响。2.根据权利要求1所述的体外系统性评估屎肠球菌的方法，其特征在于，动物饲料选自肉鸡饲料，组成包括玉米、豆粕、豆油和预混料。3.根据权利要求1所述的体外系统性评估屎肠球菌的方法，其特征在于，在试验组S1、S2中，灭菌动物饲料与模拟胃液和生理盐水的质量体积比为1g:10mL:0.1mL；在试验组S3、S4中，灭菌动物饲料与模拟胃液和屎肠球菌样品稀释液的质量体积比为1g:10mL:0.1mL，屎肠球菌的添加量为0.01亿/g动物饲料。4.根据权利要求3所述...

【专利技术属性】
技术研发人员：王铕，张小龙，陈浩，张云非，王子蔚，付大波，段垒，詹羿扬，王启军，辜玲芳，刘文悦，邱权，
申请(专利权)人：湖北华扬科技发展有限公司，
类型：发明
国别省市：