微量精子的冷冻保存方法技术

本发明专利技术公开了一种微量精子的冷冻保存方法，包括：(1)精液样本预处理，制成精子悬液；(2)精子悬液与精子冻存液按照体积比1:1混匀，得到混匀的精子悬液；(3)从麦管开口的一端按照以下顺序依次吸入样品：a.80

【技术实现步骤摘要】
微量精子的冷冻保存方法


[0001]本专利技术涉及辅助生殖
，尤其涉及一种微量精子的冻存方法以及一种直接用于ICSI的精子制备方法。

技术介绍

[0002]近年来，随着不孕不育日益成为社会重要问题，辅助生殖领域的各种技术也得到了快速发展，其中，男性生育力保存也获得了广泛的关注与研究。目前，精液冷冻保存是最主要的男性生育力保存方法，该方法操作简便，可靠性较高，适合精液化验正常的标本冷冻。但由于男性随年龄增大，精液质量呈下降趋势，在临床中遇到越来越多的少弱畸精甚至无精症患者。重度少弱精子症患者射出的精液或通过睾丸或附睾手术获得的精子一般数量少、活力差，常规冻存复苏后，往往难以找到足够的活动精子行ICSI(Intracytoplasmic sperm injection，卵细胞浆内单精子显微注射技术)授精，所以常规冻精方法不适用于对稀少精子进行冷冻保存。
[0003]微量稀少精子冷冻技术复苏后精子回收率高，不易丢失精子，且与液氮隔绝，避免了污染的可能，生物安全性高。为了避免在取卵日无法获得足量有活力的精子，提前将患者精子进行冷冻是最有效的男性生育力保存手段之一，但这也对微量精子冷冻提出了新的要求。
[0004]微量精子冷冻与常规精液冷冻有很大不同，首先，由于微量精子冷冻活动精子数量极少，这就对精子冷冻后的回收率和复苏率有较高要求；其次，微量精子解冻后通常只能用于ICSI授精，所以很多冷冻载体，如Cryopiece(超薄冷冻载片)和冷冻薄片等可以在ICSI操作皿中复苏后直接行ICSI操作；另外，微量精子冷冻也需要满足操作简便，重复性好，耗材易得的要求，这样才具备推广应用的潜力。
[0005]目前报道的冷冻载体大多已能得到较为理想的回收率和复苏率，很多也可以与ICSI操作皿配套使用，但是尚没有出现广泛应用的载体，主要还是因为这类耗材本身需求量不大，无法规模化量产，一般靠实验室自制或者定制，导致成本居高不下，且质量不稳定，冻存后的复苏率较低。此外操作也比较复杂，工作强度大，对实验人员操作水平要求较高，尽可能简化技术本身的难度和耗费时间将大大提高该项技术的可行性。
[0006]CN113712025 A公开了一种微量精子的冻存方法，该方法采用商品化塑料剥卵针作为冷冻载体，并通过对不同冷冻方法的比较认为可以不添加精子冻存液，将处理后的精子悬液吸入剥卵针后推出到管外，使其在针尖聚集成微滴，直接投入液氮冻存。该技术使用的载体剥卵针复苏率较低，最高也只有43.8％。而且虽然用了套管，但其实无法做到与液氮完全隔离，有潜在的生物污染风险。
[0007]基于现有技术，有必要开发一种载体价格低廉、操作简单、安全和复苏率高的微量精子冷冻技术。

技术实现思路

[0008]为解决上述技术问题，本专利技术提出一种微量精子的冻存方法，采用廉价的商品化麦管作为冷冻载体，冻存方法简便易行且同时保证较高的精子复苏率。本专利技术的另外一个目的在于提供一种直接用于ICSI的精子制备方法，使其降低从精子冻存、解冻到实施ICSI的复杂程度，整体具有较高的ICSI适配性，简化ICSI的操作。
[0009]本专利技术的专利技术目的是通过以下技术方案实现的：
[0010]一种微量精子的冷冻保存方法，所述方法包括以下步骤：
[0011](1)精液样本预处理，制成精子悬液；
[0012](2)精子悬液与精子冻存液按照体积比1:1混匀，静置平衡，得到混匀的精子悬液；
[0013](3)从麦管开口端按照以下顺序依次吸入样品：
[0014]a.80
‑
150μL含有10％血清的mHTF培养基；b.15
‑
25mm长度的空气；c.5
‑
10μL混匀的精子悬液；d.15
‑
25mm长度的空气；
[0015](4)密封麦管开口端，且密封后的麦管于液氮表面熏蒸5～10分钟后转移到液氮储存罐中冻存。
[0016]进一步的，所述步骤(1)中，所述精液样本的预处理步骤包括：
[0017](1
‑
1)密度梯度离心法分离精液样本，收集底部的精子沉淀，得到活力和形态较好的精子；
[0018](1
‑
2)精子沉淀用含有10％血清的mHTF培养基洗涤，再加入受精培养液，制成精子悬液。
[0019]进一步的，所述密度梯度离心法具体为：
[0020]使用密度梯度离心液，包括上层梯度液(低浓度梯度液)和下层梯度液(高浓度梯度液)，先将上层梯度液加入试管底部，再将枪头伸入试管底部，沿管壁缓慢加入等体积的下层梯度液，两层液体不可混匀，两液体间应有清晰的界面，在上层梯度液上面缓慢加入已液化的精液样本，离心，除去上部的精浆和密度梯度液，收集底部的精子沉淀，即可得到活力和形态较好的精子。
[0021]进一步的，上层梯度液的体积用量为0.5
‑
0.75mL。
[0022]所述精液样本的体积为1～3mL。
[0023]本专利技术使用的密度梯度离心液可选用市场上的商用密度梯度离心液，在本专利技术的一个实施例中，使用的是IrvineScientific的Isolate梯度离心液，包括上层梯度液(Upper Layer，REF99257)和下层梯度液(Lower Layer，REF99258)。
[0024]所述步骤(1
‑
2)中，精子悬液优选按以下方法制得：
[0025]将步骤(1
‑
1)收集的精子沉淀用含有10％血清的mHTF培养基洗涤1
‑
2次，每次3
‑
5min，弃上清，所得沉淀加入10～100μL受精培养液，将底部的精子沉淀重悬，制成精子悬液；
[0026]所述受精培养液一般先经过预平衡，所述预平衡是指：将受精培养液置于37℃，6％CO2浓度，饱和湿度的培养箱中，放置10～20小时平衡，得到预平衡的受精培养液。
[0027]所述步骤(2)中，静置平衡一般静置5～10min。
[0028]预处理中尽可能的吸取上清，可减少麦管的用量。
[0029]所述受精培养液为含有10％血清的G
‑
IVF培养基。
[0030]本专利技术中的血清是指人血清白蛋白HSA。
[0031]本专利技术中的精子冻存液可选用市场上商用的精子冻存液，在本专利技术的一个实施例中，使用的是Oligo生产的精子冻存液。
[0032]以上所述冻存的微量精液不超过100μL。
[0033]所述麦管为塑料麦管，可减小在冷冻解冻过程中因温度剧烈变化而破裂的风险，内径一般为2～3mm。在本专利技术的一个实施例中，商品化塑料麦管购自于Cryo Bio System(法国)，内径为2.5mm。
[0034]所述步骤(3)中，从麦管开口端吸入样品，一般是将麦管与注射器经过连接皮管连接，通过注射器抽吸，吸入样品。
[0035]所述步骤(3)中，吸入的样品体积，可先用精确的本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种微量精子的冷冻保存方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：(1)精液样本预处理，制成精子悬液；(2)精子悬液与精子冻存液按照体积比1:1混匀，静置平衡，得到混匀的精子悬液；(3)从麦管开口端按照以下顺序依次吸入样品：a.80～150μL含有10％血清的mHTF培养基；b.15～25mm长度的空气；c.5～10μL混匀的精子悬液；d.15～25mm长度的空气；(4)密封麦管开口端，且密封后的麦管于液氮表面熏蒸5～10分钟后转移到液氮储存罐中冻存。2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤(1)中，所述精液样本的预处理步骤包括：(1
‑
1)密度梯度离心法分离精液样本，收集底部的精子沉淀，得到活力和形态较好的精子；(1
‑
2)精子沉淀用含有10％血清的mHTF培养基洗涤，再加入受精培养液，制成精子悬液。3.如权利要求2所述的方法，其特征在于，所述步骤(1
‑
1)具体包括：使用密度梯度离心液，其包括上层梯度液和下层梯度液，先将上层梯度液加入试管底部，再将枪头伸入试管底部，沿管壁缓慢加入等体积的下层梯度液；两层液体不可混匀，两层液体间应有清晰的分界面，在上层梯度液上面缓慢加入已液化的精液样本，离心，除去上部的精浆和密度梯度液，收集底部的精子沉淀，从而得到活力和形态较好的精子。4.如权利要求2所述的方法，其特征在于，所述步骤(1
‑
2)具体包括：将步骤(1
‑
1)收集的精子沉淀用含有10％血清的mHTF培养基洗涤1～2次，每次3～5min，弃上清，所得沉淀加入10～100μL受精培养液，将底部的精子沉淀重悬，制成精子悬液。5.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤(2)...

【专利技术属性】
技术研发人员：吕萍萍，封纯，叶英辉，李景平，钱羽力，陈希婧，
申请(专利权)人：浙江大学，
类型：发明
国别省市：