一种核苷二聚体及其制备方法和在DNA合成中的应用技术

本发明专利技术提供了一种核苷二聚体及其制备方法和在DNA合成中的应用。本发明专利技术的核苷二聚体新结构采用甲基磷酸酯、β

【技术实现步骤摘要】
一种核苷二聚体及其制备方法和在DNA合成中的应用


[0001]本专利技术涉及DNA合成
，尤其是涉及一种核苷二聚体及其制备方法和在DNA合成中的应用，特别涉及一种新骨架核苷二聚体制备方法及其在DNA合成中的应用。
技术背景
[0002]合成生物学是一项颠覆性的前沿技术，被认为是继发现DNA的双螺旋结构及人类基因组计划后的第三次生物技术革命。合成生物学发展的核心是基因信息的读取、分析、设计、合成与编辑。从本质上来说，合成生物学是在分子水平上对生命系统的重新设计和改造。其中，DNA合成是合成基因组的核心环节，是合成生物学的基石。
[0003]寡核苷酸合成是DNA从头合成的起点。目前，广泛使用的寡核苷酸合成方法是由Marvin H.Caruthers等人于1987年专利技术的基于固相亚磷酰胺“脱保护、偶联、盖帽和氧化的四步法”的化学合成技术。该方法以多孔玻璃或聚苯乙烯作为固相载体，通过一个由活化、连接、封闭和氧化四步化学反应组成的循环反应连接每一个核苷酸，由3'端向5'端延伸合成寡核苷酸，最后对合成好的寡核苷酸用氨水进行切割和脱保护基处理。由于该方法合成步骤长，在合成过程中需要使用酸脱保护，存在脱保护不完全以及脱嘌呤等副反应，最终造成寡核苷酸合成错误率高、效率低、长度受限等问题，难以完全满足合成生物学对高保真、低成本DNA合成的需求，需要发展新的DNA合成技术。
[0004]采用核苷二聚体进行模块化DNA合成，可有效减少合成步骤，进而减少错误率，提高合成效率，有望进一步克服目前所采用的单一核苷单体循环寡核苷酸合成条件下耦合步骤多所致的合成效率低、错误率高的问题。比如，普通单体需要合成100次的序列，使用二聚体仅需要50次就可以完成，大大减少了反应步骤及脱保护次数，降低了错误发生的概率。
[0005]高纯度低成本的核苷二聚体是高保真模块化DNA合成的基础。为适用于现有固相亚磷酰胺合成方法，核苷二聚体通常以五价磷酸酯(P(V))为中间“接头”，5'
‑
端和3'
‑
端分别是DMTr和亚磷酰胺(P(III))结构，其常规合成流程一般是先通过核苷亚磷酰胺单体与5'
‑
OH
‑
3'
‑
O端保护核苷经过偶联、氧化、3'
‑
O端脱保护，合成核苷二聚体前体，再在3'
‑
O端偶联亚磷酰胺合成相应的核苷二聚体，因此，选择合适磷酸酯(P(V))及亚磷酰胺(P(III))，将影响核苷二聚体合成方法，乃至寡核苷酸的后处理方法，成为合成高纯度核苷二聚体关键。
[0006]已报道的核苷二聚体主要有两种磷酸酯保护基，β
‑
氰乙基保护和甲基保护，如下所示：
[0007][0008]其中采用两个β
‑
氰乙基保护基的式II是早期核苷二聚体合成优先选择的结构，这种结构易于脱保护，氨气氨解即可脱除完全；且由于现有商业化单体主要使用β
‑
氰乙基亚磷酰胺，原料易获得。但是这种二聚体中氰乙基磷酸酯(P(V))存在氰乙基易脱除的问题，柱色谱分离时为保持亚磷酰胺稳定所必需的碱性洗脱剂，会引起的高达15％的脱氰乙基化，严重影响了基于氰乙基酯的核苷二聚体的纯度，不能满足合成生物学对高保真DNA合成需求。
[0009]而选择两个甲基保护基的式III结构时，甲基磷酸酯(P(V))在合成、后处理和纯化过程中的稳定性均优于氰乙基磷酸酯。但是也存在诸多问题，一是甲酯不易脱保护，合成寡核苷酸链越长，所需脱除的甲酯越多，常用苯硫酚才能将甲酯保护脱除完全，后再使用氨水脱除其他保护基，而苯硫酚是一种带有恶臭味的剧毒化学品，不利于基于二聚体的模块化DNA合成的推广使用；二是合成亚磷酰胺(P(III))时，甲酯的稳定性不及氰乙基酯，现有文献报道的工艺均为小量的克级(1g)制备，仅应用于简单序列、短链寡核苷酸(低于30nt)的制备，对于长链寡核苷酸及高保真DNA合成未见报道。
[0010]有鉴于此，为发展高纯度低成本的核苷二聚体，提高寡核苷酸合成的效率，满足合成生物学对高保真DNA合成的需求，特提出本专利技术。

技术实现思路

[0011]本专利技术的目的之一在于提供一种核苷二聚体，该核苷二聚体采用甲基磷酸酯、β
‑
氰乙基亚磷酰胺的混合骨架，提高寡核苷酸合成的效率，满足合成生物学对高保真DNA合成的需求，所述核苷二聚体具有如下式I所示的结构：
[0012][0013]其中，B1和B2各自独立地选自取代或未取代的碱基。
[0014]本专利技术的目的之二在于提供一种所述的核苷二聚体的制备方法，所述制备方法包括以下步骤：亚磷酰胺甲酯单体1和3'
‑
OR
p
核苷2进行反应，后再进行氧化反应、脱保护基团反应，最后再和亚磷酰胺类化合物反应，得到式I所示的核苷二聚体。该制备方法实现了高纯度的核苷二聚体制备，达到了现有商品化核苷单体的水平，可满足高保真DNA合成需求。
[0015]本专利技术的目的之三在于一种所述核苷二聚体在DNA合成中的应用。通过拼接合成了200nt的DNA片段，测试结果显示其错误率仅为3.75errors/Kb，实现了高保真DNA合成。
[0016]为了实现本专利技术的上述目的，特采用以下技术方案：
[0017]第一方面，本专利技术提供一种核苷二聚体，所述核苷二聚体具有如下式I所示的结构：
[0018][0019]其中，B1和B2各自独立地选自取代或未取代的碱基。
[0020]在本专利技术中，采用甲基磷酸酯(P(V))、β
‑
氰乙基亚磷酰胺(P(III))的混合骨架，这种结构主要有以下优势：(1)中间磷酸使用甲酯保护，结构较稳定，可以得到高纯度的二聚体前体。(2)二聚体前体与氰乙基亚磷酰胺反应时，产物结构相对稳定，副产物较少。(3)在寡核苷酸脱保护方面，相较于式III结构，使用该结构单元合成的片段，甲酯含量降低了50％，脱保护速度更快，更彻底；(4)3'
‑
O端β
‑
氰乙基亚磷酰胺的二聚体适用现有的合成体系，便于二聚体在DNA合成仪上进行寡核苷酸链的合成。
[0021]优选地，所述碱基选自天然碱基、经过修饰的碱基、天然碱基的保护形式或经过修饰的碱基的保护形式中的任意一种。
[0022]优选地，所述碱基选自胞嘧啶基、鸟嘌呤基、腺嘌呤基、胸腺嘧啶基、尿嘧啶基、次黄嘌呤基、黄嘌呤基、脱氮腺嘌呤基、脱氮鸟嘌呤基、脱氮次黄嘌呤基或二氢尿嘧啶基中的任意一种。
[0023]优选地，所述碱基的取代基选自卤素、羧基、羟基、酰胺基、氨基、巯基、未取代或R
a
取代的C1
‑
C12直链或支链烷基、未取代或R
a
取代的C1
‑
C12烷氧基、未取代或R
a
取代的C1
‑
C12烷基羟基、未取代或R
a
取代的C1
‑
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【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种核苷二聚体，其特征在于，所述核苷二聚体具有如下式I所示的结构：其中，B1和B2各自独立地选自取代或未取代的碱基。2.根据权利要求1所述的核苷二聚体，其特征在于，所述碱基选自天然碱基、经过修饰的碱基、天然碱基的保护形式或经过修饰的碱基的保护形式中的任意一种。3.根据权利要求1或2所述的核苷二聚体，其特征在于，所述碱基选自胞嘧啶基、鸟嘌呤基、腺嘌呤基、胸腺嘧啶基、尿嘧啶基、次黄嘌呤基、黄嘌呤基、脱氮腺嘌呤基、脱氮鸟嘌呤基、脱氮次黄嘌呤基、二氢尿嘧啶基或假尿嘧啶基中的任意一种。4.根据权利要求1
‑
3中任一项所述的核苷二聚体，其特征在于，所述碱基的取代基选自卤素、羧基、羟基、酰胺基、氨基、巯基、未取代或R
a
取代的C1
‑
C12直链或支链烷基、未取代或R
a
取代的C1
‑
C12烷氧基、未取代或R
a
取代的C1
‑
C12烷基羟基、未取代或R
a
取代的C1
‑
C12烷基羰基、未取代或R
a
取代的C1
‑
C12烷基酰胺基、未取代或R
a
取代的C1
‑
C12烷氧基酰胺基、NR
N1
R
N2
、未取代或R
a
取代的C1
‑
C12烷基羧基、未取代或R
a
取代的C3
‑
C20环烷基、未取代或R
a
取代的C2
‑
C20杂环烷基、未取代或R
a
取代的C6
‑
C20芳基、未取代或R
a
取代的C2
‑
C20杂芳基中的任意一种；其中，R
N1
、R
N2
各自独立地选自氢、氘、C1
‑
C12直链或支链烷基中的任意一种；R
a
选自卤素、羧基、羟基、酰胺基、C1
‑
C12直链或支链烷基、C1
‑
C12烷氧基或C1
‑
C12卤代烷基中的任意一种。5.根据权利要求1
‑
4中任一项所述的核苷二聚体，其特征在于，所述B1和B2各自独立地选自如下基团，其中
“”
代表基团连接位置：代表基团连接位置：其中，R'、R”、R”'各自独立地选自氢、氘、卤素、氨基、C1
‑
C6直链或支链烷基、C1
‑
C6直链或支链烷基酰基、C6
‑
C12芳基、C6
‑
C12芳基酰基中的任意一种；优选地，所述R'、R”、R”'各自独立地选自氢、氨基、C1
‑
C3直链或支链烷基、C1
‑
C3直链或支链烷基酰基、苯基、苯基酰基中的任意一种；优选地，所述B1和B2各自独立地选自如下基团，其中代表基团连接位置：
6.根据权利要求1
‑
5中任一项所述的核苷二聚体，其特征在于，所述核苷二聚体选自如下化合物中的任意一种：下化合物中的任意一种：7.一种根据权利要求1
‑
6中任一项所述的核苷二聚体的制备方法，其特征在于，所述制备方法的合成路径如下所示：
其中，B1和B2各自独立地选自取代或未取代的碱基，R
p
为羟基保护基团。8.根据权利要求7所述的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括以下步骤：(1)亚磷酰胺甲酯单体1和3'
‑
OR
...

【专利技术属性】
技术研发人员：王升启，何小羊，石安喆，邓新秀，刘丽艳，王飞，
申请(专利权)人：中国人民解放军军事科学院军事医学研究院，
类型：发明
国别省市：