一种能够同时检测人体尿液12种儿茶酚胺及其代谢物和肌酐的样本前处理液、方法及试剂盒技术

本发明专利技术公开了一种能够同时检测人体尿液12种儿茶酚胺及其代谢物和肌酐的样本前处理液、方法及试剂盒。所述前处理液由稀释液I、稀释液II、稀释液III、稀释液IV、淋洗液I、淋洗液II、淋洗液III和淋洗液IV组成；稀释液I为含0.1~5%甲酸的5~50%甲醇；稀释液II为0.5~5%乙酸溶液；所述稀释液III为1X磷酸盐缓冲液；所述稀释液IV为10~100 mM的羟乙基哌嗪乙硫磺酸溶液；淋洗液I为甲醇；淋洗液II为5~50 mM乙酸铵溶液；淋洗液III为5~50%甲醇；所述淋洗液IV为含0.1~5%甲酸的5~50%甲醇。本发明专利技术通过对样本前处理液及LC

【技术实现步骤摘要】
一种能够同时检测人体尿液12种儿茶酚胺及其代谢物和肌酐的样本前处理液、方法及试剂盒


[0001]本专利技术属于试剂盒制备
，具体涉及一种能够同时检测人体尿液12种儿茶酚胺及其代谢物和肌酐的样本前处理液，前处理方法以及基于样本前处理液的试剂盒。

技术介绍

[0002]儿茶酚胺（catecholamines，CA）包括去甲肾上腺素（norepinephrine，NE）、肾上腺素（epinephrine，E）和多巴胺（dopamine，DA），循环系统中CA主要来源于肾上腺髓质和交感神经系统，作为重要的神经递质或激素，具有极强的生理活性，参与机体心血管系统、神经系统、内分泌系统、肾脏、平滑肌组织等多种器官系统的调节和代谢。DL
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3,4
‑
二羟基苯基二醇（3,4
‑
Dihydroxyphenyl glycol，DHPG）、4
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羟基
‑3‑
甲氧基苯乙二醇（4
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hydroxy
‑3‑
methoxyphenylethylene glycol，MHPG）、3,4
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二羟基苯乙酸（3,4
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dihydroxyphenylacetic acid，DOPAC）、半胱氨酸多巴（5
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S
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CysteinylDOPA，Cys
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DOPA）、甲氧基去甲肾上腺素（normetanephrine，NMN）、甲氧基肾上腺素（metanephrine，MN）和3
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甲氧基酪胺（3
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methoxytyramine，3
‑
MT）等为儿茶酚胺的中间代谢产物，香草扁桃酸（vanillylmandelic acid，VMA）和高香草酸（homovanillic acid，HVA）为终末代谢产物，最终均从尿液排出体外。
[0003]CA及其代谢物水平增高或降低与许多病理生理状态相关，可作为一些疾病的筛查、诊断、治疗和预后的重要生物标志物，如一些肿瘤（如嗜铬细胞瘤、副神经节瘤、神经母细胞瘤、转移性黑色素瘤等）、代谢性疾病（如多巴胺β羟化酶缺乏症、芳香族氨基酸脱羧酶缺乏症、门克斯病等）及自主神经系统疾病（如糖尿病周围神经病变、家族性淀粉样变神经损害、直立性低血压等）。
[0004]较为经典的是用于诊断神经内分泌肿瘤如嗜铬细胞瘤、副神经节瘤及神经母细胞瘤。嗜铬细胞瘤（pheochromocytoma，PCC）起源于肾上腺髓质，副神经节瘤（paraganglioma，PGL）起源于肾上腺外的交感神经链，二者（合称PPGL）能够合成、分泌和释放大量CA，引起患者血压升高和代谢性改变等一系列临床症候群，并可造成心、脑、肾等严重并发症甚至造成患者死亡。非转移性PPGL尽早诊断经手术切除可得到治愈，转移性PPGL如能早期诊断，及时手术也可延长患者生存期，因此PPGL早诊断早治疗对疾病预后有极大意义。测定CA及其代谢物是PPGL定性诊断的主要依据，国内外相关指南均推荐检测血液或尿液NE、E、DA、NMN、MN、3
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MT、HVA和VMA浓度。神经母细胞瘤（neuroblastoma，NB）起源于肾上腺髓质或椎旁交感神经系统，是婴幼儿最常见的颅外实体肿瘤，占儿童恶性肿瘤的 8%～10%，临床表现及预后具有高度异质性，患儿尿液/血清CA及代谢物水平往往同步明显升高，国内外指南均推荐检测尿VMA和HVA协助诊断，并用以评估对治疗的反应。
[0005]测定血液或尿液中CA及其代谢物对其他疾病也具有诊断意义。如转移性黑色素瘤患者血或尿Cys
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DOPA显著升高；多巴胺β羟化酶缺乏症、芳香族氨基酸脱羧酶缺乏症、门克斯病等疾病均可出现不同程度的血液或尿液DA和DOPAC升高、NE和DHPG降低；一些较为常见
的自主神经系统疾病如糖尿病周围神经病变、家族性淀粉样变神经损害、直立性低血压等会出现血或尿NE和E降低、DHPG升高；此外，MHPG是NE在中枢的主要代谢物，对一些精神疾病具有诊断意义。
[0006]血液或尿液中CA及其代谢物浓度的检测各具特点。采血时患者体位及应激状态对血中CA及代谢物水平影响较大，需固定姿势一定时间（坐位或卧位至少半小时）后再采血，且采血为有创操作，在临床实践中操作不便，同时血中CA及其代谢物浓度水平极低（pg/ml级），对检测仪器灵敏度要求极高、样本前处理更为繁琐耗时，检测成本高昂，难以推广临床应用。尿液中CA及其代谢物浓度水平相对较高（ng/ml及μg/ml级）且恒定，尿液无创易获得。而随机尿采集方便、快速，患者依从性较好，但易受尿液浓缩程度影响，由于人体肌酐（Creatinine，Cr）的产生及排泌相对稳定，能够准确反映肾脏对尿液的浓缩程度，因此通过同时检测随机尿中肌酐浓度以校正CA代谢物浓度，可以实现对随机尿的临床检测。但对于一些肌酐产生下降（如长期卧床者、身体消瘦者）或排泌受限（如肾功能不全者）的患者，则需结合24小时尿量来定量，现有检测尿CA及其代谢物的方法还存在以下缺陷：（1）检测方法的灵敏度、特异度、便捷性较低。如专利申请CN104062388B、CN107462647B、CN114994211A和CN115015426A，采用的是高效液相色谱法（HPLC）、高效液相色谱
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电化学法（HPLC
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ECD）等检测尿液CA及其代谢物，HPLC法灵敏度有限，且检测易受体内众多干扰物影响，导致准确性降低；HPLC
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ECD法样本前处理繁琐耗时、检测时间长，也易受很多物质的干扰。
[0007]（2）基本需采集24小时尿进行检测，耗时长且易出错。由于人体的随机尿液浓缩程度差异较大，尿液中物质的浓度差异亦较大，往往需采集一整天24小时尿量来对尿液中分泌的物质进行综合定量，故目前检测尿液儿茶酚胺及其代谢物基本上是采集24小时尿进行的，但采集24小时尿耗时长且易出错，亦不便于门诊患者及特殊患者（如婴幼儿患者、长期卧床患者）操作，影响了肿瘤辅助诊断的准确性和快捷性。
[0008]（3）尿样前处理步骤繁琐耗时、效率低。如专利申请CN113917007A、CN114441664A、CN109709255A和CN109142594A，各自的检测方法均在尿液前处理时需进行酸化高温水解、衍生化反应、固相萃取洗脱液需氮气吹干后复溶等步骤，耗时长、不易控制，增加试剂成本和时间成本，也影响其在临床的使用。
[0009]综上所述，开发一种简便、经济的能够同时检测人体24小时尿及随机尿液儿茶酚胺及其代谢物和肌酐的样本前处理液及前处理方法是非常必要的且具有现实的临床应用价值。

技术实现思路

[0010]本专利技术的第一目的在于提供一种能够同时检测人体尿液12种儿茶酚胺及其代谢物和肌酐的样本前处理液，本专利技术的第二目的在于提供一种能够同时检测人体尿液12种儿茶酚胺及其代谢物和肌酐的样本前处理方法本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种能够同时检测人体尿液12种儿茶酚胺及其代谢物和肌酐的样本前处理液，所述12种儿茶酚胺及其代谢物为去甲肾上腺素、肾上腺素、多巴胺、3,4
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二羟基苯基二醇、4
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羟基
‑3‑
甲氧基苯乙二醇、3,4
‑
二羟基苯乙酸、5
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S
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半胱氨酸多巴、甲氧基去甲肾上腺素、甲氧基肾上腺素、3
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甲氧酪胺、香草扁桃酸和高香草酸，其特征在于，所述样本为尿液、校准品和质控品，所述样本前处理液由稀释液和淋洗液组成；其中，所述稀释液由稀释液I、稀释液II、稀释液III及稀释液IV组成；稀释液I为含0.1~5%甲酸的5~50%甲醇；所述稀释液II为0.5~5%乙酸溶液；所述稀释液III为1X磷酸盐缓冲液；所述稀释液IV为10~100 mM的羟乙基哌嗪乙硫磺酸溶液；所述淋洗液由淋洗液I、淋洗液II、淋洗液III和淋洗液IV组成；所述淋洗液I为甲醇；所述淋洗液II为5~50 mM乙酸铵溶液；所述淋洗液III为5~50%甲醇；所述淋洗液IV为含0.1~5%甲酸的5~50%甲醇。2.根据权利要求1所述样本前处理液，其特征在于，所述校准品由去甲肾上腺素、肾上腺素、多巴胺、3,4
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二羟基苯基二醇、4
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羟基
‑3‑
甲氧基苯乙二醇、3,4
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二羟基苯乙酸、5
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S
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半胱氨酸多巴、甲氧基去甲肾上腺素、甲氧基肾上腺素、3
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甲氧酪胺、香草扁桃酸、高香草酸和肌酐组成；去甲肾上腺素、肾上腺素、多巴胺的浓度范围为12.5~800 ng/ml，3,4
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二羟基苯基二醇、4
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羟基
‑3‑
甲氧基苯乙二醇、3,4
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二羟基苯乙酸、5
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S
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半胱氨酸多巴的浓度范围为0.3~20 μg/ml，香草扁桃酸、高香草酸的浓度范围为0.6~40 μg/ml，甲氧基去甲肾上腺素、甲氧基肾上腺素、3
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甲氧酪胺的浓度范围为6.3~400 ng/ml，肌酐的浓度范围为63~4000 μg/ml。3.根据权利要求1所述样本前处理液，其特征在于，所述质控品由低质控品和高质控品组成；其中，低质控品中去甲肾上腺素、肾上腺素、多巴胺的浓度为60 ng/ml，3,4
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二羟基苯基二醇、4
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羟基
‑3‑
甲氧基苯乙二醇、3,4
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二羟基苯乙酸、5
‑
S
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半胱氨酸多巴的浓度为2 μg/ml，香草扁桃酸、高香草酸的浓度为3 μg/ml，甲氧基去甲肾上腺素、甲氧基肾上腺素、3
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甲氧酪胺的浓度为30 ng/ml，肌酐的浓度为300 μg/ml；高质控品中去甲肾上腺素、肾上腺素、多巴胺的浓度为600 ng/ml，3,4
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二羟基苯基二醇、4
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羟基
‑3‑
甲氧基苯乙二醇、3,4
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二羟基苯乙酸、5
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S
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半胱氨酸多巴的浓度为18 μg/ml，香草扁桃酸、高香草酸的浓度为30 μg/ml，甲氧基去甲肾上腺素、甲氧基肾上腺素、3
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甲氧酪胺的浓度为300 ng/ml，肌酐的浓度为3000 μg/ml。4.一种基于权利要求1所述能够同时检测人体尿液12种儿茶酚胺及其代谢物和肌酐的样本前处理方法，其特征在于，该样本前处理方法包括前处理步骤一及前处理步骤二；所述前处理步骤一是将样本、稀释液和内标液直接混合后高速离心取上清液得到处理后的进样液一，离心速率为10000~14000 rpm，离心时长为5~10 分钟；所述前处理步骤二是将样本、稀释液和内标液混合后进行固相萃取，得到的萃取液为处理后的进样液二；最后对处理后的样液一和进样液二进行LC
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MS/MS检测；在前处理步骤一中，系列校准品/质控品的体系配制方法为：分别取20 μL校准品/质控品、200 μL稀释液II及20 μL内标液混匀；尿液样本的体系配制方法为：分别取20 μL尿样、200 μL稀释液II及20 μL内标液混匀；
在前处理步骤二中，系列校准品/质控品的体系配制方法为：分别取30 μL校准品/质控品、270 μL稀释液III、20 μL内标及450 μL稀释液IV混合；尿液样本的体系配制方法为：分别取30 μL稀释液I、270 μL尿样、20 μL内...

【专利技术属性】
技术研发人员：张峻，陈寒梅，
申请(专利权)人：昆明医科大学第一附属医院，
类型：发明
国别省市：