一种基于数字PCR平台的食管癌基因检测引物、探针及试剂盒制造技术

本发明专利技术公开了一种基于数字PCR平台的食管癌基因检测引物、探针及试剂盒，属于分子生物学检测技术领域。所述试剂盒至少包括食管癌基因检测引物、探针序列，数字PCR反应预混液、引物混合液、探针混合液、超纯水、阳性质控品、阴性质控品。检测方法包括：待检样本核酸提取、检测体系制备、微滴制备、芯片扩增、芯片阅读、结果判定等步骤。本发明专利技术能够快速、准确检测出样本中食管癌基因的生物标记物，医生根据这些生物标记物判断是否患有食管癌的风险；为医生临床诊断和治疗提供了指导方案，同时也可在术后为患者实行动态监测。为患者实行动态监测。为患者实行动态监测。

【技术实现步骤摘要】
一种基于数字PCR平台的食管癌基因检测引物、探针及试剂盒


[0001]本专利技术涉及分子生物学检测
，具体地说，涉及一种基于数字PCR平台的食管癌基因检测引物、探针及试剂盒。

技术介绍

[0002]食管癌(Esophagus cancer，EC)：是世界第六大致命癌症，影响着全球45万多人。在中国，EC是每年癌症相关死亡的第四大原因。EC常见的临床和病理分型包括鳞状细胞癌和腺癌，约占食管癌的95％以上，其中鳞癌所占比例达到93％，腺癌只占很小比例，剩余5％为非常少见的食管恶性肿瘤，如食管的神经内分泌瘤、黑色素瘤等。食管癌的高发病率与吸烟、喝热茶和口腔健康等许多因素都一定的相关性。
[0003]当前诊断EC的常用方法是纤维胃镜、钡剂检查、计算机断层扫描(CT)。但这些诊断方法耗时、费用高，且不能在早期准确诊断。因此，需要制定有效的诊断和治疗方法，利用分子标记的手段特异性识别食管癌基因上的关键生物标记物，做到早筛干预和术后动态监测。

技术实现思路

[0004]针对现有技术存在的不足之处，本专利技术提供一种能够在短时间内准确检测出样本中食管癌基因的生物标记物。通过食管癌基因的检测，提高易感人群自身患癌额风险认识，具有一定的检测预防意义；对于早期检测发现的食管癌，也能做到早发现、早治疗，提高患者生存率。
[0005]本专利技术解决技术问题采用如下技术方案：
[0006]一种基于数字PCR平台的食管癌基因的生物标记物检测的对应检测引物、探针序列包括以下一组或多组任意组合：
[0007](1)正向引物:5'
‑
GCTGTGAGCTCTGCTCTGAA
‑
3',
[0008]反向引物：5'
‑
CGGATGTCGTTCCTCTCCAG
‑
3',
[0009]探针:5'
‑
FAM
‑
ACGGCTGCCTCAAGTGCTCACCCAA
‑
BHQ1
‑
3'；
[0010](2)正向引物:5'
‑
GGGTTTCCTGTTCCTCCTTCTG
‑
3',
[0011]反向引物：5'
‑
AGTAGCCTTTTCCAGCAACAC
‑
3',
[0012]探针:5'
‑
VIC
‑
TCGGCCTGACCCAGCCCCCAT
‑
BHQ1
‑
3'；
[0013](3)正向引物：5'
‑
TGTGACACTGGATGGAGGGA
‑
3',
[0014]反向引物：5'
‑
CGTGGGTGAGTGTCAGGATG
‑
3',
[0015]探针:5'
‑
ROX
‑
CTTGTTCACCTGCAGAAATGGGACGG
‑
BHQ2
‑
3'；
[0016](4)正向引物：5'
‑
GATCGCCATGACGCTGGAAG
‑
3',
[0017]反向引物：5'
‑
AACTTGGCCGACTCGTACAC
‑
3',
[0018]探针:5'Atto 425
‑
TGCGACAACGCGGCGCAGAA
‑
BHQ1
‑
3'；
[0019](5)正向引物：5'
‑
TGCATCCGAGCCTTCTGC
‑
3',
[0020]反向引物：5'
‑
CTGTCTCTTCCTCACGCTGG
‑
3',
[0021]探针:5'CY5.5
‑
CCCAGCGGTGCCTGAACCCAG
‑
BHQ3
‑
3'；
[0022](6)正向引物：5'
‑
AGGTCCACTGACACGTT
‑
3',
[0023]反向引物：5'
‑
GCCTCAAGATCATCAGCAAT
‑
3',
[0024]探针:5'
‑
CY5
‑
ACCACAGTCCATGCCATCACTGCC
‑
BHQ1
‑
3'。
[0025]同时，本专利技术提供一种基于数字PCR平台的食管癌基因检测试剂盒，所述试剂盒包括数字PCR反应预混液、引物混合液、探针混合液、超纯水，其中，所述引物混合液包括权利要求1所述的一种或多种引物对、探针混合液包括引物对所对应的探针。
[0026]其中，所述试剂盒还包括阳性质控品、阴性质控品，所述阴性质控品是无核酸水，阳性质控品是人工合成的食道癌靶标基因核酸片段。
[0027]其中，所述Tris
‑
HCl为20mM、dNTP为200nM、DNA聚合酶为1.0u/uL、MgCl2为5mM、逆转录酶为200u/uL。
[0028]一种基于数字PCR平台的食管癌基因检测方法，包括以下步骤：
[0029](1)待检样本核酸提取；使用The RNeasy FFPE Kit ofQiagen提取石蜡切片样本，获得核酸溶液；
[0030](2)检测体系制备：检测体系制备包括权利要求1所述的食管癌基因对应检测引物混合液、探针混合液，数字PCR反应预混液、阳性对照和阴性对照。其中，食管癌基因对应检测引物、探针序列配制的混合体系，不加待检核酸和阴阳质控品的为体系P1。
[0031](3)微滴制备；将体系P1加入步骤(1)中的待检样本核酸溶液、步骤(2)中的阴性对照或阳性对照，振荡混匀，离心后采用微滴制备仪获得微滴芯片；
[0032](4)芯片扩增；将步骤(3)获得的微滴芯片放入芯片扩增仪，对其核酸样本进行扩增；
[0033](5)芯片阅读；指通过芯片阅读软件完成芯片阅读，并通过荧光通道的数值判定待检样本含量；根据样本含量判定是否含有食管癌基因。
[0034]其中，所述芯片扩增的扩增程序为：50℃15min；85℃5min；{95℃15s，60℃30s}*40cycles；25℃50s；25℃10s；扩增时间60min。
[0035]其中，所述数字PCR反应预混液体积比占比20％、引物混合液引物浓度10mM，含量体积比占比13.33％，探针混合液的探针浓度为10mM，体积占比6.67％、超纯水体积占比26.67％、待检样本核酸体积占比33.33％。
[0036]有益效果
[0037]1、本专利技术检测食管癌基因的生物标记物检测的对应检测引物、探针序列准确，对食道癌基因的识别检测率高。<本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种基于数字PCR平台的食管癌基因检测引物和探针，其特征在于，所述食管癌基因对应检测引物、探针序列包括以下一组或多组任意组合：(1)正向引物:5'
‑
GCTGTGAGCTCTGCTCTGAA
‑
3',反向引物：5'
‑
CGGATGTCGTTCCTCTCCAG
‑
3',探针:5'
‑
FAM
‑
ACGGCTGCCTCAAGTGCTCACCCAA
‑
BHQ1
‑
3'；(2)正向引物:5'
‑
GGGTTTCCTGTTCCTCCTTCTG
‑
3',反向引物：5'
‑
AGTAGCCTTTTCCAGCAACAC
‑
3',探针:5'
‑
VIC
‑
TCGGCCTGACCCAGCCCCCAT
‑
BHQ1
‑
3'；(3)正向引物：5'TGTGACACTGGATGGAGGGA
‑
3',反向引物：5'
‑
CGTGGGTGAGTGTCAGGATG
‑
3',探针:5'
‑
ROX
‑
CTTGTTCACCTGCAGAAATGGGACGG
‑
BHQ2
‑
3'；(4)正向引物：5'GATCGCCATGACGCTGGAAG
‑
3',反向引物：5'AACTTGGCCGACTCGTACAC
‑
3',探针:5'Atto425
‑
TGCGACAACGCGGCGCAGAA
‑
BHQ1
‑
3'；(5)正向引物：5'TGCATCCGAGCCTTCTGC
‑
3',反向引物：5'CTGTCTCTTCCTCACGCTGG
‑
3',探针:5'CY5.5
‑
CCCAGCGGTGCCTGAACCCAG
‑
BHQ3
‑
3'；(6)正向引物：5'
‑
AGGTCCACTGACACGTT
‑
3',反向引物...

【专利技术属性】
技术研发人员：张鸿，高轩，江静，王成，
申请(专利权)人：芜湖胤星医学检验实验室有限公司，
类型：发明
国别省市：