评价小鼠精子抗原特异性T细胞反应的方法技术

本发明专利技术公开了评价小鼠精子抗原特异性T细胞反应的方法，涉及抗原特异性T细胞技术领域。该评价小鼠精子抗原特异性T细胞反应的方法，通过构建精子特异性表达卵清蛋白(OVA)抗原的转基因小鼠和应用细胞过继转移构建了一种基于流式细胞术的简单方案，用于定量分析OVA免疫的小鼠的精子抗原引流淋巴结和脾脏中的抗原特异性CD4+T细胞体内反应，该方案量化了过继转移的OVA特异性TCR转基因CD4T(OT

【技术实现步骤摘要】
评价小鼠精子抗原特异性T细胞反应的方法


[0001]本专利技术涉及抗原特异性T细胞
，具体为评价小鼠精子抗原特异性T细胞反应的方法。

技术介绍

[0002]抗原提呈细胞(APC)是指能摄取和在细胞内加工处理抗原，并将抗原信息提呈给T淋巴细胞的细胞。通常所指的抗原提呈细胞包括树突状细胞(DC)、巨噬细胞(Mφ)、B淋巴细胞等表达MHCII类分子的细胞，也将其称为专职性抗原提呈细胞(APC)。树突状细胞(DC)是目前所知抗原提呈功能最强的APC，最大的特点是能够刺激初始型T细胞活化和增殖，而Mφ、B淋巴细胞等仅能刺激已活化的T细胞或记忆性T细胞，因此，DC是特异性免疫应答的始动者。随着对不同组织来源DC研究的深入，目前已知的DC亚群包括存在于淋巴组织、血液和非淋巴组织的经典DC(cDC)，以及分泌I型干扰素的浆细胞样DC(pDC)，分别具有不同的表型及功能。其中，经典DC的主要功能是诱导针对入侵抗原的特异性免疫应答并维持自身耐受，而pDC的主要功能则是针对微生物，特别是病毒感染产生大量的I型干扰素并激活相应的T细胞。T细胞和抗原呈递细胞(APC)之间的结合对于激活抗原特异性T细胞是必不可少的，但定量精子抗原依赖性T细胞
‑
APC结合是困难的。
[0003]因此，如何设计评价小鼠精子抗原特异性T细胞反应的方法是业界亟待解决的技术问题。

技术实现思路

[0004]本专利技术的目的在于提供评价小鼠精子抗原特异性T细胞反应的方法，旨在解决定量精子抗原依赖性T细胞
‑
>APC结合的问题。
[0005]本专利技术是这样实现的，评价小鼠精子抗原特异性T细胞反应的方法，包括以下步骤：S1、将CD4+TOT
‑
2细胞分离富集和过继转移到经过OVA精子和佐剂免疫后的野生型45.1小鼠体内；S2、对小鼠的脾脏淋巴结组织进行样品收集、酶消化以及细胞染色；S3、基于流式细胞术，对经过细胞染色后的样本进行上机分析，并对检测出的数据进行记录；S4、对记录的数据结果进行分析。
[0006]进一步地，所述S1包括以下步骤：S11、CD4+T细胞即为载体构建，构建在精子上特异性表达异种鸡卵清蛋白抗原的转基因小鼠；S12、对CD45.1小鼠进行佐剂免疫操作。
[0007]进一步地，所述S11包括以下步骤：S111、根据设计方案，设计并构建转基因载体，通过酶切和测序验证载体序列的正确性；S112、将转基因载体样品进行显微注射，将转基因载体样品显微注射到C57BL/6JGpt背景的小鼠受精卵中，然后取注射后存活的受精卵移植到假孕雌鼠体内，待其怀孕产仔；S113、对F0代小鼠进行基因鉴定，受体鼠生出的F0代小仔在5
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7天剪尾及剪脚趾编号，提取基因组DNA进行PCR鉴定，确认基因型；S114、对结果进行记录与分析，确保成功构建精子特异性表达OVA抗原小鼠。
[0008]进一步地，所述S12包括以下步骤：S121、在OT
‑
2细胞转染前一天，安乐死精子特异
性表达OVA的小鼠，用表达OVA的精子细胞悬液和FCA按照1：1混合乳化均匀后免疫同源性CD45.1小鼠的右后足垫，每个足垫注射量为20uL，操作时间为30秒/只；S122、从成年的雄性OVA特异性T细胞受体转基因OT
‑
2小鼠中分离CD4+T细胞，其中使用具有同源性CD45.1小鼠作为受体；S123、在异氟醚轻度麻醉下，将CD45.2供体OT
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2细胞的5x106个细胞反向转移到1天前用OVA和佐剂免疫的野生型CD45.1受体小鼠中。
[0009]进一步地，所述S122包括以下步骤：S1221、安乐死供体OT
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2小鼠，并将脾脏和所有皮下淋巴结收集到100um的细胞过滤器中，该过滤器放置在带有2mL预冷培养基的5cm培养皿中，该所述预冷培养基为RPMI1640培养基，其中含有10％FBS；i、用3mL注射器的无菌注射器活塞将切碎的组织碎片在100um细胞过滤器的底部研磨；ii、加入2mL含有5mg/mL胶原酶D的RPMI1640消化培养基，并加入10％FBS，形成最终浓度为2.5mg/mL胶原酶D；iii、将培养皿置于5％CO2培养箱中，并在37℃下培养30分钟；S1222、将脾脏和所有淋巴结用细剪刀剪成大小为1mm的碎片；S1223、按照说明书使用分选试剂盒分选CD4T细胞；S1224、洗涤分离的OT
‑
2细胞并将其悬浮在冰冷的磷酸盐缓冲液中，其浓度为1*107cells/mL。
[0010]进一步地，所述S122步骤中从一只OT
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2小鼠中获得1x108个总脾和淋巴结细胞，其中1.5
–
2.0x107个细胞通过使用试剂盒分离至纯度为90％
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95％的CD4+OT
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2细胞。
[0011]进一步地，所述S2包括以下步骤：S21、对小鼠的淋巴结细胞组织进行样品收集，并对样品进行酶消化；S22、对酶消化后的细胞组织进行染色，用抗体染色细胞表面标记物。
[0012]进一步地，所述S21包括以下步骤：S211、在对小鼠进行安乐死之前，通过在24孔板的每个孔的底部放置1*1cm2的100um尼龙网；a.每孔加入200uL培养基，该培养基为含有10％FBS的RPMI1640培养基；b.根据需要准备尽可能多的孔，以便每个孔一个小鼠皮下淋巴结，收集时，将板子放在冰上；S212、在OT
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2细胞转移后7天安乐死小鼠，并收集腹股沟区引流淋巴结；S213、机械破坏皮下淋巴结；a.用细剪刀将皮下淋巴结切成小块；b.用1mL注射器的柱塞将皮下淋巴结块研磨在尼龙网上，轻轻搅拌；c.用800uLRPMI1640和10％FBS清洗剪刀和柱塞，使孔内的体积为1ml；S214、消化皮下淋巴结，每孔添加10uL0.25g/mL胶原酶D，并在37℃的5％CO2培养箱中培养30分钟；S215、用1mL微量移液管轻轻地向上和向下吸移孔中的培养基，收集消化的皮下淋巴结细胞悬浮液，以便皮下淋巴结组织的任何残余物将从尼龙网上分离；S216、在1.5mL管的顶部放置1x1cm2尼龙网，并使整个消化的细胞悬浮液通过网；S217、取10uL进行细胞计数，用0.6mL冰冷磷酸盐缓冲液洗涤，并使洗涤液通过尼龙网，将细胞悬浮液放在冰上；S218、在500xg4度离心5分钟，去除上清液，并通过轻轻移液将细胞重新悬浮在200uL含10％FBS的RPMI1640中，将细胞悬浮液转移至96孔V形底板；S219、在850xg4度离心2分钟，然后将上清液倾倒到水槽或废物容器中；S2110、清洗细胞；a.轻轻旋转平板；b.通过多通道移液器加入200uL/孔不含EDTA的磷酸盐缓冲液来清洗细胞；c.在4℃下以450xg离心5分钟；d.将上清液倒入废液容器。
[0013]进一步地，所述S22包括以下步骤：S221、染色死细胞；a.通过轻轻涡旋开细胞沉淀使其成为单细胞悬液，并加入本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.评价小鼠精子抗原特异性T细胞反应的方法，包括以下步骤：S1、将CD4+TOT
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2细胞分离富集和过继转移到经过OVA精子和佐剂免疫后的野生型45.1小鼠体内；S2、对小鼠的脾脏淋巴结组织进行样品收集、酶消化以及细胞染色；S3、基于流式细胞术，对经过细胞染色后的样本进行上机分析，并对检测出的数据进行记录；S4、对记录的数据结果进行分析。2.根据权利要求1所述的评价小鼠精子抗原特异性T细胞反应的方法，其特征在于，所述S1包括以下步骤：S11、CD4+T细胞即为载体构建，构建在精子上特异性表达异种鸡卵清蛋白抗原的转基因小鼠；S12、对CD45.1小鼠进行佐剂免疫操作。3.根据权利要求2所述的评价小鼠精子抗原特异性T细胞反应的方法，其特征在于，所述S11包括以下步骤：S111、根据设计方案，设计并构建转基因载体，通过酶切和测序验证载体序列的正确性；S112、将转基因载体样品进行显微注射，将转基因载体样品显微注射到C57BL/6JGpt背景的小鼠受精卵中，然后取注射后存活的受精卵移植到假孕雌鼠体内，待其怀孕产仔；S113、对F0代小鼠进行基因鉴定，受体鼠生出的F0代小仔在5
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7天剪尾及剪脚趾编号，提取基因组DNA进行PCR鉴定，确认基因型；S114、对结果进行记录与分析，确保成功构建精子特异性表达OVA抗原小鼠。4.根据权利要求2所述的评价小鼠精子抗原特异性T细胞反应的方法，其特征在于，所述S12包括以下步骤：S121、在OT
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2细胞转染前一天，安乐死精子特异性表达OVA的小鼠，用表达OVA的精子细胞悬液和FCA按照1：1混合乳化均匀后免疫同源性CD45.1小鼠的右后足垫，每个足垫注射量为20uL，操作时间为30秒/只；S122、从成年的雄性OVA特异性T细胞受体转基因OT
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2小鼠中分离CD4+T细胞，其中使用具有同源性CD45.1小鼠作为受体；S123、在异氟醚轻度麻醉下，将CD45.2供体OT
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2细胞的5x106个细胞反向转移到1天前用OVA和佐剂免疫的野生型CD45.1受体小鼠中。5.根据权利要求4所述的评价小鼠精子抗原特异性T细胞反应的方法，其特征在于，所述S122包括以下步骤：S1221、安乐死供体OT
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2小鼠，并将脾脏和所有皮下淋巴结收集到100um的细胞过滤器中，该过滤器放置在带有2mL预冷培养基的5cm培养皿中，该所述预冷培养基为RPMI1640培养基，其中含有10％FBS；i、用3mL注射器的无菌注射器活塞将切碎的组织碎片在100um细胞过滤器的底部研磨；ii、加入2mL含有5mg/mL胶原酶D的RPMI1640消化培养基，并加入10％FBS，形成最终浓度为2.5mg/mL胶原酶D；iii、将培养皿置于5％CO2培养箱中，并在37℃下培养30分钟；
S1222、将脾脏和所有淋巴结用细剪刀剪成大小为1mm的碎片；S1223、按照说明书使用分选试剂盒分选CD4T细胞；S1224、洗涤分离的OT
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2细胞并将其悬浮在冰冷的磷酸盐缓冲液中，其浓度为1*107cells/mL。6.根据权利要求5所述的评价小鼠精子抗原特异性T细胞反应的方法，其特征在于：所述S122步骤中从一只OT
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2小鼠中获得1x108个总脾和淋巴结细胞，其中1.5
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2.0x107个细胞通过使用试剂盒分离至纯度为90％
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95％的CD4+OT
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2细胞。7.根据权利要求1所述的评价小鼠精子抗原特异性T细胞反应的方法，其特征在于，所述S2包括...

【专利技术属性】
技术研发人员：段永刚，曾群雄，杨宸，刘金川，
申请(专利权)人：香港大学深圳医院，
类型：发明
国别省市：