一种检测目的蛋白含量的系统及应用其的检测方法技术方案

本发明专利技术提供一种检测目的蛋白含量的系统，该系统包括：(1)与目的蛋白结合的第一抗体，带有第一标记物且与目的蛋白结合的第二抗体，与所述第一标记物结合的偶联物；(2)带有与偶联物相结合的第二标记物的单链脱氧核糖核酸串联体，单链脱氧核糖核酸串联体由引物交换反应制得；(3)与单链脱氧核糖核酸串联体相结合的启动子序列，与启动子序列相结合的核糖核酸聚合酶；(4)Cas13a蛋白、crRNA和带有荧光标记的RNA底物。本发明专利技术提供的检测目的蛋白含量的系统，用于血清微量IL

【技术实现步骤摘要】
一种检测目的蛋白含量的系统及应用其的检测方法


[0001]本专利技术属于分子生物学
，具体地，涉及一种检测目的蛋白含量的系统及应用其的检测方法。

技术介绍

[0002]Cas13a是一种
Ⅳ‑
A型RNA核糖核酸酶，能降解由CRISPR RNA(crRNA)靶向的RNA链，其中crRNA与靶RNA特异性结合后，crRNA
‑
靶RNA双链会结合在LbuCas13a蛋白核酸酶(NUC)叶的正电荷中心通道上，使Cas13a蛋白发生显著的构象变化，触发高等真核生物和原核生物核苷酸结合(HEPN)1结构域向HEPN2结构域移动，激活Cas13a蛋白的HEPN催化位点，从而以非特异方式切割单链RNA。
[0003]细胞因子是一系列由免疫细胞如T细胞、B细胞、NK细胞和巨噬细胞以及一些非免疫细胞合成并分泌的具有广泛生物学活性的可溶性小分子蛋白，其作为一种分子信使，允许免疫系统细胞间彼此通信，以产生对靶抗原的协调作用，在许多疾病中具有免疫调节和效应功能。目前有研究指出，外周血细胞因子的水平与肿瘤免疫治疗疗效有密切关系，可用于预测肿瘤免疫治疗疗效，与当前临床用于免疫治疗预测的标志物如肿瘤组织PD
‑
L1表达水平、肿瘤突变负荷检测(TMB)以及微卫星不稳定(MSI)相比，外周血细胞因子检测具有取样简单、检测成本低和可持续监测等优点，使其更加适用于临床免疫治疗疗效预测。
[0004]然而，部分细胞因子在外周血含量较低，目前临床用于检测外周血蛋白的方法主要为酶介导的化学发光体系或显色体系，如电化学发光、ELISA，这些方法的敏感度不够，检测蛋白的下限仅为0.01～50ng/mL，无法区分细胞因子含量较低的样品。
[0005]为了提高蛋白检测的敏感性，需要建立一种具有高灵敏度的蛋白检测系统。

技术实现思路

[0006]本专利技术的目的在于提供一种检测目的蛋白含量的系统及应用其的检测方法，显著提高了蛋白检测的灵敏度，扩大了蛋白检测的适用浓度范围。
[0007]根据本专利技术的第一个方面，提供一种检测目的蛋白含量的系统，系统包括：(1)与目的蛋白结合的第一抗体，带有第一标记物且与目的蛋白结合的第二抗体，与所述第一标记物相结合的偶联物；(2)带有与偶联物相结合的第二标记物的单链脱氧核糖核酸串联体，单链脱氧核糖核酸串联体由引物交换反应制得；(3)与单链脱氧核糖核酸串联体相结合的启动子序列，与启动子序列相结合的核糖核酸聚合酶；(4)Cas13a蛋白、crRNA和带有荧光标记的RNA底物。
[0008]本专利技术选用的检测目的蛋白含量的系统进行检测，利用与目的蛋白结合的第一抗体，带有第一标记物且与目的蛋白结合的第二抗体，可以通过ELISA双抗体夹心的方法捕获目的蛋白；第一标记物通过偶联物与第二标记物相结合，并利用带有第二标记物的单链脱氧核糖核酸串联体，完成从蛋白信号到核酸信号的转换；利用与单链脱氧核糖核酸串联体相结合的启动子序列，与启动子序列相结合的核糖核酸聚合酶，从而生成对应的靶核糖核
酸；利用Cas13a蛋白、crRNA和带有荧光标记的RNA底物，将CRISPR/Cas13a作为报告系统，在crRNA引导下，Cas13a蛋白特异靶向靶RNA，使Cas13a旁切酶活性被激活，切割周围带有荧光标记的RNA底物(也就是RNA荧光报告探针)，释放荧光信号；最后通过分析荧光强度，计算靶蛋白浓度(当Cas13a、crRNA和靶RNA均存在的情况下，才能检测到荧光信号上升)。本专利技术提供的检测目的蛋白含量的系统，可根据目的蛋白，更换对应的第一抗体和第二抗体，从而实现检测系统的通用性，显著提高了蛋白检测的灵敏度。
[0009]优选地，单链脱氧核糖核酸串联体是一段以2个碱基TT开头、由碱基A连接重复序列CAACTTAAC的序列，长度为2500
±
500nt。
[0010]优选地，启动子序列为T7启动子。
[0011]由于选择预先合成的单链脱氧核糖核酸串联体是一段以2个碱基TT开头、由碱基A连接重复序列CAACTTAAC的序列，长度为2500
±
500nt，理论上可与近百个带有T7启动子序列的探针进行杂交，从而达到第一次信号放大。并且，利用(3)中的物料组成TMA转录体系，使核糖核酸聚合酶(也就是T7 RNA聚合酶)与T7启动子序列(T7启动子序列是AS/S探针的其中一部分序列)结合，从而启动转录，生成靶RNA，达到第二次信号放大。将CRISPR/Cas13a作为检测系统，在crRNA引导下，靶RNA特异性与crRNA结合，使Cas13a发生构象变化并被激活，从而高效的、无差别的切割周围ssRNA，此时体系中的RNA荧光报告探针也被切割，释放出荧光信号，从而达到第三次信号放大。本专利技术提供的检测目的蛋白含量的系统采用三次信号放大，显著提高了蛋白检测的灵敏度。
[0012]优选地，crRNA选用T3 crRNA，T3 crRNA的序列如SEQ ID NO.11所示。
[0013]针对靶RNA序列，在每隔3个碱基处设计了识别不同靶RNA序列位置的crRNA分子，针对选出来的crRNA分子识别靶RNA序列的长短进行了分析，按照检测结果分析，发现采用序列如SEQ ID NO.11所示的T3 crRNA进行检测，测得的荧光斜率均高于其他crRNA。
[0014]优选地，带有荧光标记的RNA底物为RNAse Alert公司的实验室检测试剂盒v2荧光探针(下文均用v2荧光探针表示)。
[0015]对CRISPR/Cas13a体系中的荧光探针进行了选择，在相同的2μM浓度下选择了v2、UUAUU、UUUUU这三种荧光探针进行测试，可以发现，v2所获得的荧光斜率最高(P值均小于0.0001)。RNAse Alert公司的实验室检测试剂盒v2荧光探针，采用一种全新且灵敏度更高的新型RNA底物，该底物一端标记有荧光报告基团分子(fluor)和另一端标记有淬灭基团。
[0016]优选地，第一标记物为生物素，偶联物为链霉亲和素，第二标记物为生物素。
[0017]由于生物素与链霉亲和素之间可以相互结合，因此第一标记物和第二标记物选用生物素，偶联物选用链霉亲和素，由此通过偶联物使第一标记物与第二标记物相连接，就可将带有第一标记物的第二抗体，与带有第二标记物的单链脱氧核糖核酸串联体相互桥连，使与第二抗体结合的目的蛋白的蛋白信号转换成单链脱氧核糖核酸串联体的核酸信号，由此扩大了需检测蛋白信号可使用的检测手段。
[0018]优选地，该系统为试剂盒。
[0019]根据本专利技术的第二个方面，提供一种基于上述检测目的蛋白含量的系统的蛋白含量检测方法，包括以下步骤：S1.目的蛋白捕获：采用与目的蛋白结合的第一抗体、带有第一标记物且与目的蛋白结合的第二抗体，通过ELISA双抗体夹心的方法，捕获目的蛋白；S2.蛋白信号转换：将偶联物加入体系，令偶联物与S1中带有第一标记物的第二抗体相结合，洗涤
去掉多余偶联物后，将带有第本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种检测目的蛋白含量的系统，其特征在于，所述系统包括：(1)与目的蛋白结合的第一抗体，带有第一标记物且与所述目的蛋白结合的第二抗体，与所述第一标记物相结合的偶联物；(2)带有与所述偶联物相结合的第二标记物的单链脱氧核糖核酸串联体，所述单链脱氧核糖核酸串联体由引物交换反应制得；(3)与所述单链脱氧核糖核酸串联体相结合的启动子序列，与所述启动子序列相结合的核糖核酸聚合酶；(4)Cas13a蛋白、crRNA和带有荧光标记的RNA底物。2.如权利要求1所述检测目的蛋白含量的系统，其特征在于，所述单链脱氧核糖核酸串联体是一段以2个碱基TT开头、由碱基A连接重复序列CAACTTAAC的序列，长度为2500
±
500nt。3.如权利要求1所述检测目的蛋白含量的系统，其特征在于，所述启动子序列为T7启动子。4.如权利要求1所述检测目的蛋白含量的系统，其特征在于，所述crRNA选用T3 crRNA，所述T3 crRNA的序列如SEQ ID NO.11所示。5.如权利要求1所述检测目的蛋白含量的系统，其特征在于，所述带有荧光标记的RNA底物为V2荧光探针。6.如权利要求1所述检测目的蛋白含量的系统，其特征在于，所述第一标记物为生物素，所述偶联物为链霉亲和素，所述第二标记物为生物素。7.如权利要求1所述检测目的蛋白含量的系统，其特征在于，所述系统为试剂盒。8.一种基于如权利要求1～7任一项所述检...

【专利技术属性】
技术研发人员：毋亚仙，邢珊，刘万里，
申请(专利权)人：中山大学肿瘤防治中心中山大学附属肿瘤医院，中山大学肿瘤研究所，
类型：发明
国别省市：