类粘蛋白Orm在提高球孢白僵菌环境抵抗力上的应用制造技术

本发明专利技术涉及类粘蛋白Orm在提高球孢白僵菌环境抵抗力上的应用，属于生物农药技术领域。本申请在具有优良性状的球孢白僵菌菌株基础上，使用基因工程的手段构建Orm高表达的白僵菌菌株，获得环境胁迫抵抗力和杀虫活力大幅提高的球孢白僵菌OE

【技术实现步骤摘要】
类粘蛋白Orm在提高球孢白僵菌环境抵抗力上的应用


[0001]本专利技术涉及类粘蛋白Orm在提高球孢白僵菌环境抵抗力上的应用，属于生物农药


技术介绍

[0002]害虫防治是目前各种农作物生产过程亟需解决的问题。地下害虫由于在地下活动，具有隐蔽性，是国际上公认的难以预测和防治的重大害虫, 主要为害植物的种苗、根系及块茎等。蛴螬是地下害虫中分布最广、种类最多、为害最重的一大类群，不仅造成减产, 而且可引起根腐病等病害发生。数据显示, 植物地下部分受害中86%是由蛴螬为害造成的。
[0003]目前市面上防治蛴螬类害虫，常采取化学防治，所用化学药剂有辛硫磷、甲基异柳磷等，拌种、拌土使用。但这种方法存在诸多问题，首先，农药使用过量会导致空气污染、水体污染、土壤板结等环境问题。其次，长期使用同种农药会提升蛴螬对农药的抵抗力，产生抗药性，使用效果降低。最后，农药使用会影响土壤微生物种群，甚至干扰自然生态平衡。
[0004]目前高毒化学药剂被逐步禁用，可防治蛴螬的高效药剂减少且剂型单一，蛴螬抗药性逐步增加，生物防治是最理想的防治手段。球孢白僵菌，属半知菌亚门，白僵菌属，是一类杀虫谱广、致病力强的昆虫病原真菌，通过在作物根表、根际定植、繁殖和转移，充分发挥菌株的杀虫、活化土壤等功能，提高有机农作物产量、产值。使用白僵菌进行防治，针对蛴螬能够达到70%～85%的防治效果。并且研究对比发现，拌土的效果高于喷雾，在土壤中施入白僵菌，能够起到很好的防治效果，药效能够持续到第二年。球孢白僵菌防治蛴螬的有效成分是孢子或菌丝的侵染体，具体原理为：
①
分生孢子附着在寄主体壁上；
②
孢子在适宜条件下萌发形成菌丝，在机械压力和酶解双重作用下，穿透体壁进入寄主血腔；
③
真菌利用寄主体内营养，芽殖产生大量芽生孢子，而这种细胞构造可以在宿主血腔内自由分散和入侵宿主免疫防御系统；
④
当宿主营养耗尽，芽生孢子形成菌丝体，穿透宿主的组织和体壁，进行腐生生长并产生分生孢子，完成一个生命周期。此过程为自然侵染，昆虫不产生抗性。但是现有技术表明，传统球孢白僵菌致病力弱，环境胁迫抵抗力低，现有菌剂配方存在萌发率低、稳定性和定殖效果差等问题，在实际田间应用中效果欠佳，制约球孢白僵菌菌剂发展。

技术实现思路

[0005]针对传统球孢白僵菌致病力弱，环境胁迫抵抗力低，现有菌剂配方存在萌发率低、稳定性和定殖效果差等问题，在实际田间应用中效果欠佳等问题，本申请在具有优良性状的球孢白僵菌菌株基础上，使用基因工程的手段构建Orm高表达的白僵菌菌株，获得环境胁迫抵抗力和杀虫活力大幅提高的球孢白僵菌OE
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BbOrm。
[0006]本申请技术方案如下：类粘蛋白Orm在提高球孢白僵菌环境抵抗力上的应用，所述类粘蛋白Orm的碱基序列如SEQ ID No .1所示。
[0007]本专利技术的另一个目的保护，含有类粘蛋白Orm的菌剂在提高球孢白僵菌环境抵抗
力上的应用，所述类粘蛋白Orm的碱基序列如SEQ ID No .1所示。
[0008]进一步地，所述的应用还包括防治蛴螬。
[0009]本专利技术的另一个目的保护，一种Orm1超量表达工程菌，通过构建类粘蛋白Orm1基因全长cDNA组成性表达载体pAN52
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Orm1
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Bar，转化球孢白僵菌，筛选后获得权利要求1所述的Orm1类粘蛋白的超量表达菌株OE
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BbOrm1，即为Orm1超量表达工程菌。
[0010]优选地，表达载体pAN52
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Orm1
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Bar中类粘蛋白基因来自球孢白僵菌Bb2860。
[0011]优选地，筛选的方法为挑取正常生长单菌落，提取DNA，利用特异引物A、特异引物B通过RT
‑
PCR检测各个转化子中Orm1的表达量，并以18sRNA作为内参；从中挑选表达量最高的转化子，即为筛选的菌株；特异性引物A的碱基序列如SEQ ID No.2所示，具体为：5'
ꢀ‑
GGTCGGCTCTTACATCAT
‑
3'；特异性引物B的碱基序列如SEQ ID No.2所示，具体为：3'
ꢀ‑
CAAGGTCGTAGTGCGTATA
‑
5'。
[0012]本专利技术选用球孢白僵菌作为原料，在前期研究球孢白僵菌的分子生物学基础上，对球孢白僵菌的多个基因进行功能研究。发现球孢白僵菌的鞘脂含量在环境应激反应中具有重要作用，鞘脂是细胞膜结构的重要组成部分，鞘脂及其代谢中间产物可作为重要的信号分子，在细胞信号转导、细胞抗逆反应以及细胞的生长、分化、衰老、凋亡等细胞基本活动过程中发挥重要的调节作用。鞘脂的合成是从丝氨酸和软脂酰辅酶A 开始，经丝氨酸软脂酰辅酶A 转移酶(serine
‑
palmitoyl
‑
transferase, SPT)催化缩合，产生3
‑
酮基鞘氨醇, 并释放出CoA和CO2。SPT 作为鞘脂合成的起始和限速酶，是由TSC3p
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LCB2p
‑
LCB1p 三个蛋白构成的，而鞘脂合成途径的调控因子血清类黏蛋白(orosomucoid,Orm) 通过与SPT 结合，实现对SPT 酶活的调节，从而影响细胞内鞘脂的平衡。类粘蛋白Orm调控丝氨酸棕榈酷转移酶SPT活性是鞘脂合成代谢通路的关键步骤（图1）这表明昆虫病原真菌中类粘蛋白（Orm）是一种可能的致病因子。利用基因工程手段，构建真菌Orm超表达载体，转化白僵菌，获得Orm超量表达的工程菌。通过筛选，得到环境胁迫抵抗力和杀虫活力大幅提高的球孢白僵菌OE
‑
BbOrm。
[0013]本专利技术的有益效果本专利技术的球孢白僵菌OE
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BbOrm的类粘蛋白（Orm）的表达效率与含量相较于野生型提高4.5倍，其环境胁迫抵抗力和杀虫效果较野生型菌株大大提高，具体表现在抗紫外能力提高27%，耐高温能力提高20%，抗氧化能力提高31%，对蛴螬的半数致死时间LT50缩短2.8天；使得生产成本降低30%。
附图说明
[0014]图1为鞘脂合成代谢通路；图2为定量PCR检测Orm表达量；图3为不同球孢白僵菌供试菌株的菌落大小；图4为不同球孢白僵菌供试菌株的产孢量；图5为感染球孢白僵菌OE
‑
BbOrm的蛴螬僵虫；图6为不同球孢白僵菌供试菌株对蛴螬幼虫LT50的测定结果；
图7 为不同球孢白僵菌供试菌株环境胁迫抵抗力的测定结果。
具体实施方式
[0015]本具体实施例仅仅是对本专利技术的解释，其并不是对本专利技术的限制，本领域技术人员在阅读完本说明书后可以根据需要对本实施例做出没有创造性贡献的修改，但只要在本专利技术的权利要求范围内都受到专利法的保护。
[0016]实施例1球孢白僵菌菌株的构建与筛选，包括以下步骤：1、构本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.类粘蛋白Orm在提高球孢白僵菌环境抵抗力上的应用，其特征在于，所述类粘蛋白Orm的碱基序列如SEQ ID No.1所示。2.含有类粘蛋白Orm的菌剂在提高球孢白僵菌环境抵抗力上的应用，其特征在于，所述类粘蛋白Orm的碱基序列如SEQ ID No.1所示。3.根据权利要求1或2所述的应用，其特征在于，所述的应用还包括防治蛴螬。4.一种类粘蛋白Orm超量表达工程菌，其特征在于，通过构建类粘蛋白Orm基因全长cDNA组成性表达载体pAN52
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Orm
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Bar，转化球孢白僵菌，筛选后获得权利要求1所述的类粘蛋白Orm的超量表达菌株OE
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BbOrm，即为Orm超量表达工程菌。5.根据权利要求4所述的工程菌，其特征在于，表达载体pAN52<...

【专利技术属性】
技术研发人员：宋俊辉，张优，王彤彤，卢楚雯，赵国祥，时呈青，王欣宇，王娟娟，邱磊，
申请(专利权)人：济南大学，
类型：发明
国别省市：