一种软硬相接植物组织石蜡切片的制备方法技术

本发明专利技术公开了一种软硬相接植物组织石蜡切片的制备方法，涉及植物组织切片技术领域。所述的石蜡切片的制备方法中包括固定、软化、脱水、浸蜡、包埋、切片与展片、脱蜡及复水、番红固绿染色和封片步骤。本发明专利技术中通过对石蜡切片的制备步骤进行改进，具体包括软化液、其浓度、软化时间、脱水等步骤，保证了使用上述制备方法制备软硬相接植物组织石蜡切片时，对幼嫩腋芽细胞组织破坏性较小，又能达到木质化较硬的主茎部位的软化要求。主茎部位的软化要求。主茎部位的软化要求。

【技术实现步骤摘要】
一种软硬相接植物组织石蜡切片的制备方法


[0001]本专利技术涉及植物组织切片
，具体涉及一种软硬相接植物组织石蜡切片的制备方法。

技术介绍

[0002]蝴蝶兰（Phalaenopsis）为兰科（Orchidaeeae）蝴蝶兰属（Phalaenosis）植物，是一种多年生草本植物，蝴蝶兰最高经济价值的花部组织之一即花梗，花梗是从蝴蝶兰的茎部着生的叶子基部的潜伏芽点萌发并伸长形成的。
[0003]石蜡切片技术是一种用于镜下观察细胞形态的方法，通常包括取材、固定、脱水、透明、透蜡、包埋、切片、贴片、染色、透明、封片等步骤，可以使用石蜡切片进行植物显微结构的研究。研究者通常需要借助石蜡切片观察着生于茎部的蝴蝶兰花梗从腋芽阶段萌发、生长的发育过程的微观变化。
[0004]植物石蜡切片有不少关于花芽的切片报道，中国专利CN202210103528中公开了一种适用于紫薇花芽的石蜡切片方法，在脱水过程中按照50%乙醇（30min）
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70%乙醇（30min）
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70%乙醇过夜
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85%乙醇（50min）
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95%乙醇（50min）
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100%乙醇（50min）
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100%乙醇（50min）的梯度进行，并且在透明、浸蜡、包埋、切片厚度及染色方法上进行改进，使得该专利技术的石蜡切片的制备方法简单易操作，提高了切片的成功率、切片效果较佳。
[0005]中国专利CN201811595700.4中公开了一种观察花芽分化过程的石蜡切片的制作方法，包括植物样本取材固定、脱水透明、透蜡包埋、蜡块修正切片、粘片展片、染色封固，所述植物样本取材固定包括：剖离基生在植物根状茎上的叶片后，切取植物茎尖中心组织，浸入装有FPA固定液的容器中，并将所述容器置于真空干燥器内，使样品沉底，得到固定样本。该专利技术的固定方法减少了幼嫩材料固定后变脆的情况。
[0006]目前现有技术中关于其他花部组织关注很少，对蝴蝶兰不同组织部位相关研究报道更少，尤其是两种不同软硬度组织紧密连接的切片还未有相关研究制片方法。而蝴蝶兰较高经济价值的商业流行兰花，腋芽发育形成花梗的过程是现今兰花产业研究的热点和重点，石蜡切片制作的质量严重影响到其微观形态发育过程观察所需。观察发现茎部存在木质化严重的现象，而花芽组织非常幼嫩，因此在进行石蜡切片制作时，在试材的软化阶段会出现茎段与腋芽紧密相连，然而由于茎段与腋芽的软硬度差异极大，采用常规的软化方法会出现木质化的茎段需要的软化时间较长，而导致幼嫩腋芽出现软化时间过长而碎烂的现象；或者幼嫩腋芽软化时间合适，而木质化茎段仍然太硬无法达到下一步包埋的要求，因此对于处理同一植株上紧密连接不可分割的两种不同软硬度的植物组织，采用常规的软化方法无法获得完整的蜡带，后续切片过程中也常伴有脱片、叠片的情况，因此无法进行研究所需的微观形态观察。
[0007]本研究根据蝴蝶兰茎段和潜伏芽的生长特点及组织软硬度的差异，对石蜡切片的操作步骤进行了优化，既能够保证不伤害幼嫩腋芽又能使较硬茎段很好的达到软化效果。形成了一套能够应用于蝴蝶兰石蜡切片过程中所需的不同软硬度相接的植物组织材料石
蜡切片的制备方法，并能很好的获得高质量石蜡切片进行后续微观形态的观察研究。

技术实现思路

[0008]本专利技术的目的是提供一种软硬相接植物组织石蜡切片的制备方法，通过对石蜡切片的制备方法进行调整，解决了现有技术中采用常规的石蜡切片制备方法处理同一植株上紧密连接不可分割的两种不同软硬度的植物组织，无法获得完整的蜡带的问题。
[0009]为实现上述专利技术目的，本专利技术的技术方案如下：一方面，本专利技术提供了一种软硬相接植物组织石蜡切片的制备方法，包括以下步骤：（1）固定：取植物组织到固定液中进行固定，对固定液进行1
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3次抽气，固定时间48h
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96h；（2）软化：加入8
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14%氢氟酸软化液，抽真空20
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50分钟，软化的时间为10
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15天；（3）脱水：将软化后的组织置于30%酒精中保持2小时、50%酒精中保持2小时、70%酒精中保持2小时、80%酒精中保持1小时、90%酒精中保持1小时、无水乙醇中保持2小时、醇苯中保持1小时、二甲苯中保持2小时；（4）浸蜡：脱水完成后材料在恒温箱中浸入融化石蜡；（5）包埋：将浸好蜡的组织于包埋机内进行包埋；（6）切片与展片：使用石蜡切片机切片，切片漂浮于40℃温水上将组织展平，在40℃条件下烤片；（7）脱蜡及复水：将切片放入二甲苯中保持8分钟
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在纯二甲苯与无水乙醇的混合液中保持3秒
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在无水乙醇中保持3秒
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在90%酒精中保持3秒
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在80%酒精中保持3秒
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在70%酒精中保持3秒
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在50%酒精中保持3秒
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在30%酒精中保持3秒，在水中保持3秒；（8）染色：植物组织切片放入番红染液后水洗
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在50%酒精中保持3秒
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在70%酒精中保持3秒
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等酒精晾干后，切片入固绿染液，切片经过三次无水乙醇快速脱水，每次3s；（9）封片：切片入二甲苯，使用中性树胶封片。
[0010]优选地，步骤（1）中所述的植物组织为蝴蝶兰植物组织。
[0011]进一步优选地，所述的植物组织取自花梗与茎芽相连的部位。
[0012]进一步优选地，所述的植物组织的大小为直径3
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10 mm，长度为12
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20mm。
[0013]优选地，步骤（1）中所述的固定液为FAA固定液。
[0014]进一步优选地，所述的FAA固定液的组分包括5%福尔马林、5%冰醋酸和90%的50%质量分数的乙醇。
[0015]进一步优选地，所述的植物组织与固定液的质量体积比为1:20。
[0016]优选地，步骤（1）中所述的抽气的次数为3次，所述的固定的时间为48h。
[0017]优选地，步骤（2）中所述的氢氟酸的浓度为10%。
[0018]优选地，步骤（2）中所述的软化的时间为12天。
[0019]优选地，步骤（2）中所述的植物组织与软化液的质量体积比为1:20。
[0020]优选地，步骤（2）中所述的抽真空的时间为30分钟。
[0021]优选地，抽真空后将其放入55℃鼓风干燥箱中，进行软化。
[0022]优选地，软化后放入到流水中过夜，将其洗至中性。
[0023]优选地，步骤（4）中恒温箱的温度为65℃。
[0024]优选地，步骤（4）中浸蜡具体为脱水完成后材料在65℃恒温箱中浸入融化石蜡1h，更换融化石蜡，浸入融化石蜡1d，再次更换融化石蜡，浸入融化石蜡1d。
[0025]优选地，步骤（5）中包埋结束蜡凝固后将蜡块从包埋框中取出修正蜡块。...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种软硬相接植物组织石蜡切片的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：（1）固定：取植物组织到固定液中进行固定，对固定液进行1
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3次抽气，固定时间48h
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96h；（2）软化：加入8
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14%氢氟酸软化液，抽真空20
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50分钟，软化的时间为10
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15天；（3）脱水：将软化后的组织置于30%酒精中保持2小时、50%酒精中保持2小时、70%酒精中保持2小时、80%酒精中保持1小时、90%酒精中保持1小时、无水乙醇中保持2小时、醇苯中保持1小时、二甲苯中保持2小时；（4）浸蜡：脱水完成后在恒温箱中浸入融化石蜡；（5）包埋：将浸好蜡的组织于包埋机内进行包埋；（6）切片与展片：使用石蜡切片机切片，切片漂浮于40℃温水上将组织展平，在40℃条件下烤片；（7）脱蜡及复水：将切片放入二甲苯中保持8分钟
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在纯二甲苯与无水乙醇的混合液中保持3秒
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在无水乙醇中保持3秒
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在90%酒精中保持3秒
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在80%酒精中保持3秒
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在70%酒精中保持3秒
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在50%酒精中保持3秒
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在30%酒精中保持3秒，在水中保...

【专利技术属性】
技术研发人员：李佐，贺雅萍，肖文芳，吕复兵，陈和明，妟石娟，
申请(专利权)人：广东省农业科学院环境园艺研究所，
类型：发明
国别省市：