本发明专利技术公开了一种基于镜面干涉增强的多焦点宽场超分辨显微成像方法及装置，具体的说，利用激发光经数字微镜调制或空间光调制器形成稀疏多焦点激发点阵，由于反射镜的作用，聚焦的高斯型光斑的轴向尺寸被压缩且光强显著增加，大幅提升成像层析能力及图像信噪比，同时提高成像的时间分辨率以及荧光收集效率。切换点阵位置可实现样品的多焦点扫描并通过相机采集信号，使用计算机进行一系列后处理即可在短时间内获得高信噪比的超分辨图像。基于上述方法，搭建由多焦点激发点阵生成模块、宽场显微成像模块、反射镜样品模块以及信号采集模块组成的多焦点宽场超分辨显微成像装置，实现在高时间分辨率的情况下，高信噪比、操作简易的超分辨显微成像技术。易的超分辨显微成像技术。易的超分辨显微成像技术。
【技术实现步骤摘要】
一种基于镜面干涉增强的多焦点宽场超分辨显微成像方法及装置
[0001]本专利技术涉及光学显微成像的
，尤其涉及一种基于镜面干涉增强的多焦点宽场超分辨显微成像方法及装置。
技术介绍
[0002]光学超分辨显微成像技术是生物医学研究中重要的工具之一，其中的多焦点结构光照明显微技术由于其更大的成像范围及更高的成像速度而具有非常大的应用潜力，但在成像速度上仍有非常大的改进空间。在产生稀疏激发点阵过程中，点阵的间隔越稀疏，扫描的帧数越多，最终的重构图像的信噪比越高，但同时也意味着成像所需的时间更长，不利于样品的实时观测，同时也会带来光漂白的问题使得重构图像失真。
[0003]因此，基于该技术存在的问题，亟待研发一种在保证时间分辨率的同时还能提高成像信噪比的方法。
技术实现思路
[0004]针对现有技术的不足，本专利技术旨在于提供一种基于镜面干涉增强的多焦点宽场超分辨显微成像方法及装置，使得时间分辨率保持在较高水平的前提下，提高样品图像的信噪比。
[0005]为解决上述技术问题，本专利技术采用的技术方案如下：
[0006]一种基于镜面干涉增强的多焦点宽场超分辨显微成像方法，所述方法包括以下步骤：
[0007]S1激光器发射出激发光，经过双凸透镜扩束两倍后，照射在数字微镜器件或空间光调制器上，经数字微镜或空间光调制器调制的反射光束汇聚在4f滤波系统的后焦面上形成稀疏激发点阵，并且其位置与显微镜管镜的前焦面重合，以确保数字微镜的光学反射面与管镜的前焦面共轭，激发点阵再经过由管镜和物镜构成的显微系统，并最终在物镜后焦面上获得与数字微镜光学反射面共轭的稀疏多焦点激发点阵；
[0008]S2聚焦的高斯型光斑从物镜出射后，由于反射镜的作用，聚焦光斑未入射镜面部分与从镜面反射出来的部分发生自干涉，在反射镜表面形成一个轴向尺寸压缩4倍且光强增加约3.5倍干涉增强点；
[0009]S3利用荧光探针标记样品，并将其置于反射镜表面，通过控制数字微镜或空间光调制器切换激发点阵位置，相机同步记录各个位置的荧光信号，达到多焦点并行扫描的效果，由于镜面干涉增强效应提高了图像信噪比，可有效减少扫描步数，提升时间分辨率为原来的2
‑
3倍，对采集到的一系列多焦点激发的样品图像进行数字针孔滤波、像素重定位、图像叠加以及反卷积处理，可重构出高信噪比的超分辨图像。
[0010]需要说明的是，所述稀疏多焦点激发点阵在样品面上由于反射镜的作用，聚焦光斑未入射镜面部分与从镜面反射出来的部分发生自干涉，在反射镜表面形成一个轴向尺寸
压缩4倍的干涉增强点，更小的光斑轴向尺寸大大降低了离焦背景信号以及有效提升了多焦点宽场显微镜的光学层析能力。
[0011]需要说明的是，所述稀疏多焦点激发点阵在样品面上由于反射镜的作用，聚焦光斑未入射镜面部分与从镜面反射出来的部分发生自干涉，在反射镜表面形成一个光强增加约3.5倍干涉增强点，同时反射镜的加入可进一步提高荧光收集效率，因此荧光信号增强后的图像信噪比将明显得到提升，高信噪比图像可有效减少荧光串扰对多焦点重构的影响，进而可以设置更小的焦点间距进行多焦点并行扫描，提升成像的时间分辨率。
[0012]需要说明的是，所述步骤S3中的多焦点激发的样品图像进行重构包括：
[0013]①
定位所有激发点阵的位置，并添加数字针孔进行空间滤波；
[0014]②
对针孔滤波后的图像进行像素重定位，既插值获取两倍于原始像素数的图像；
[0015]③
将所有经步骤
①②
处理后的图像进行叠加获得较宽场显微镜1.5倍分辨率提升的重构图像；
[0016]④
对叠加后的图像进行反卷积处理，进一步获得较宽场显微镜2倍分辨率提升的超分辨图像。
[0017]本专利技术还提供一种基于镜面干涉增强的多焦点宽场超分辨显微成像装置，所述装置包括多焦点激发点阵生成模块、宽场显微成像模块、反射镜样品模块以及信号采集模块。其中，所述激发光生成模块用于生成稀疏多焦点激发点阵，并切换不同的激发点阵位置，通过镜面干涉模块后激发点阵发生干涉增强，由信号采集模块采集样品被扫描激发产生的荧光信号。
[0018]需要说明的是，所述多焦点激发点阵生成模块包括连续激光器，双凸透镜扩束系统，反射镜，数字微镜或空间光调制器以及4f滤波系统；其中，连续性激光器出射激发光经过扩束系统光束直径扩大到原来直径的2倍后利用反射镜改变光束方向，使其以24
°
入射角照射在数字微镜上；数字微镜由若干的微型方形反射镜构成，可通过反射镜下方的铰链在
±
12
°
之间快速切换，当入射光与DMD面的法线成24
°
时，微反射镜会将照射光垂直于数字微镜反射面反射进入后续的4f滤波系统，滤除多余的衍射级的反射光,以免产生杂散光干扰；经调控的反射光束会聚在4f滤波系统透镜的后焦面上形成稀疏的激发点阵,并且其位置与宽场显微成像模块的管镜前焦面重合,以确保数字微镜的光学反射面与管镜的前焦面共轭。
[0019]需要说明的是，所述宽场显微成像模块包括激发光路管镜、二向镜以及物镜；多焦点激发点阵生成模块产生的稀疏点阵经过激发光路管镜聚焦，以及可用于分离激发光与荧光的二向色镜后，由物镜聚焦到荧光探针标记的反射镜样品模块；焦点激发点阵生成模块产生的稀疏点阵与样品面共轭，经过由激发光路管镜和物镜构成的显微系统，尺寸缩小为原来的1/167后成像到样品面上。
[0020]需要说明的是，所述反射镜样品模块从上往下依次是玻璃/硅基底、镀银/金层、二氧化硅保护层、具有荧光探针标记的样品和盖玻片。
[0021]需要说明的是，所述信号采集模块包括同轴放置的荧光光路管镜，滤光片以及相机。样品被增强的激发模式激发后产生的荧光信号经过二向镜和滤光片滤光后，由荧光光路管镜聚焦到探测面，相机采集信号并发送至计算机；切换激发点阵的位置以扫描样品，将收集到一系列多焦点激发的样品图像，最后由计算机对样品图像进行数字针孔滤波、像素
重定位、图像叠加以及反卷积处理，可重构出高信噪比的超分辨图像。
[0022]本专利技术的有益效果在于，本专利技术提供了镜面干涉增强的多焦点宽场超分辨显微成像方法及装置，通过稀疏多焦点激发点阵的镜面干涉，得到轴向尺寸压缩4倍同时光强增强3.5倍的激发模式。其中，轴向尺寸的缩小大大降低了离焦背景信号以及有效提升了多焦点宽场显微镜的光学层析能力(～110nm)；荧光信号增强后，通过计算机重构，图像信噪比将明显得到提升，高信噪比图像可有效减少荧光串扰对多焦点重构的影响，进而可以设置更小的焦点间距进行多焦点并行扫描，提升成像的时间分辨率为2
‑
3倍左右。
附图说明
[0023]图1为本专利技术所提供的基于镜面干涉增强的多焦点宽场超分辨显微成像装置的光路图；
[0024]图2a和图2b为无镜面和有镜面情况下的显微镜轴向照明点扩散函数；
[0025]图2c为无镜面本文档来自技高网...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
1.一种基于镜面干涉增强的多焦点宽场超分辨显微成像方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：S1激光器发射出激发光，经过双凸透镜扩束两倍后，照射在数字微镜器件或空间光调制器上，经数字微镜或空间光调制器调制的反射光束汇聚在4f滤波系统的后焦面上形成稀疏激发点阵，并且其位置与显微镜管镜的前焦面重合，以确保数字微镜的光学反射面与管镜的前焦面共轭，激发点阵再经过由管镜和物镜构成的显微系统，并最终在物镜后焦面上获得与数字微镜光学反射面共轭的稀疏多焦点激发点阵；S2聚焦的高斯型光斑从物镜出射后，由于反射镜的作用，聚焦光斑未入射镜面部分与从镜面反射出来的部分发生自干涉，在反射镜表面形成一个光场轴向分布尺寸压缩4倍且光场强度增加约3.5倍的干涉增强点；S3利用荧光探针标记样品，并将其置于反射镜表面，通过控制数字微镜或空间光调制器切换激发点阵位置，相机同步记录各个位置的荧光信号，达到多焦点并行扫描的效果，由于镜面干涉增强效应提高了图像信噪比，可有效减少扫描步数，提升时间分辨率为原来的2
‑
3倍，对采集到的一系列多焦点激发的样品图像进行数字针孔滤波、像素重定位、图像叠加以及反卷积处理，可重构出高信噪比的超分辨图像。2.根据权利要求1所述的基于镜面干涉增强的多焦点宽场超分辨显微成像方法，其特征在于，所述稀疏多焦点激发点阵在样品面上由于反射镜的作用，聚焦光斑未入射镜面部分与从镜面反射出来的部分发生自干涉，在反射镜表面形成一个轴向尺寸压缩4倍的干涉增强点，更小的光斑轴向尺寸大大降低了离焦背景信号以及有效提升了多焦点宽场显微镜的光学层析能力，可实现约110nm的轴向分辨率。3.根据权利要求1或2所述的基于镜面干涉增强的多焦点宽场超分辨显微成像方法，其特征在于，所述稀疏多焦点激发点阵在样品面上由于反射镜的作用，聚焦光斑未入射镜面部分与从镜面反射出来的部分发生自干涉，在反射镜表面形成一个光强增加约3.5倍干涉增强点，同时反射镜的加入可进一步提高荧光收集效率，因此荧光信号增强后的图像信噪比将明显得到提升，高信噪比图像可有效减少荧光串扰对多焦点重构的影响，进而可以设置更小的焦点间距进行多焦点并行扫描，提升成像的时间分辨率。4.根据权利要求1所述的基于镜面干涉增强的多焦点宽场超分辨显微成像方法，其特征在于，所述步骤S3中的多焦点激发的样品图像进行重构包括：
①
定位所有激发点阵的位置，并添加数字针孔进行空间滤波；
②
对针孔滤波后的图像进行像素重定位，既插值获取两倍于原始像素数的图像；
③
将所有经步骤
①②
处理后的图像进行叠加获得较宽场显微镜1.5倍分辨率提升的重构图像；
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【专利技术属性】
技术研发人员：王保举，刘心雨，何杰轩，潘彬雄，刘子叶，詹求强，
申请(专利权)人：华南师范大学，
类型：发明
国别省市：
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