一种大熊猫TSHβ单克隆抗体及其杂交瘤细胞株和应用制造技术

本发明专利技术提供了一种大熊猫TSHβ单克隆抗体及其杂交瘤细胞株和应用，属于生物免疫学技术领域。该大熊猫TSHβ单克隆抗体重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。本发明专利技术提供了一种大熊猫TSHβ单克隆抗体及其杂交瘤细胞株TSHB

【技术实现步骤摘要】
一种大熊猫TSH
β
单克隆抗体及其杂交瘤细胞株和应用


[0001]本专利技术属于生物免疫学
，具体公开了一种大熊猫TSHβ单克隆抗体及其杂交瘤细胞株和应用。

技术介绍

[0002]促甲状腺素（TSH）是垂体前叶分泌的一种糖蛋白激素，它由一个通用的糖蛋白亚基和一个特异的促甲状腺素β亚基非共价结合，形成二聚体分泌蛋白。TSH主要调控甲状腺的发育和甲状腺素的正常代谢，进而调控动物生长、发育、能量代谢以及繁殖等生命过程。人TSHβ基因，它包含3个外显子，编码一个含138个氨基酸残基的前体蛋白，其氨基端含有20个氨基酸残基的信号序列SHB主要在动物垂体组织表达，也有研究发现其在小肠、性腺表达。另外，人和小鼠TSHβ均存在剪接体，新剪接体不仅表达于垂体，而且在外周血白细胞、甲状腺与骨髓等其他组织也有表达。由于种属差异的原因，目前没有特异的抗大熊猫TSHβ亚基特异抗体，因此关于大熊猫TSHβ亚基相关的表达研究尚未报道。

技术实现思路

[0003]本专利技术的第一目的在于提供一种大熊猫TSHβ单克隆抗体杂交瘤细胞株，其能够解决现目前无法获得大熊猫TSHβ特异性抗体的技术问题。
[0004]本专利技术的第二目的在于提供一种大熊猫TSHβ单克隆抗体，以解决现有技术中没有特异的抗大熊猫TSHβ特异抗体的问题。
[0005]为实现上述目的，本专利技术解决其技术问题所采用的技术方案是：一种大熊猫TSHβ单克隆抗体，其重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。
[0006]进一步地，其亚型为IgG1。
[0007]一种表达载体，包括上述大熊猫TSHβ单克隆抗体。
[0008]一种分泌上述大熊猫TSHβ单克隆抗体的杂交瘤细胞株TSHB
‑
A，该杂交瘤细胞株TSHB
‑
A的保藏号为CCTCC NO：C202282，于2022年3月27日保藏于中国武汉武汉大学中国典型培养物保藏中心。
[0009]上述大熊猫TSHβ单克隆抗体在大熊猫促甲状腺素检测中的应用。
[0010]一种用于检测大熊猫TSH的试剂盒，包括上述大熊猫TSHβ单克隆抗体。
[0011]进一步地，试剂盒为Western Blot检测用试剂盒。
[0012]与现有技术相比，本专利技术至少具有如下的优点与积极效果：本专利技术提供了一种大熊猫TSHβ单克隆抗体及其杂交瘤细胞株，能够通过杂交瘤细胞株分泌得到大熊猫TSHβ单克隆抗体，并且该抗体能准确识别目标蛋白TSHβ亚基，为TSH蛋白的定位和组织表达信息、特异性配体、拮抗物、抗拮抗物的发现创造条件，此外，还可利用TSH高特异性的单克隆抗体对TSH受体的配体、拮抗物、抗拮抗物进行更进一步的深入研究。
附图说明
[0013]为了更清楚地说明本专利技术实施例的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，应当理解，以下附图仅示出了本专利技术的某些实施例，因此不应被看作是对范围的限定，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他相关的附图。
[0014]图1为本专利技术实施例1中细胞蛋白浓度的标准曲线图；图2为本专利技术实施例2中Western
‑
blot检测结果。
具体实施方式
[0015]为使本专利技术实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本专利技术实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。
[0016]需要说明的是，在不冲突的情况下，本申请中的实施例及实施例中的特征可以相互组合。下面将参考具体实施例来详细说明本专利技术。
[0017]实施例11. 抗大熊猫TSHβ单克隆抗体的制备：1.1特异多肽片段的设计与合成：根据NCBI数据库大熊猫TSHβ氨基酸序列，登录号：XP_002925358.1，序列为：MTAIYLMSmLFGLACGQVMSFCFPTEYTMHVERKECAYCLTINTTICAGYCMTRDINGKLFLPKYALSQDVCTYKDFMYKTVEIPGCPRHVTPYFSYPVAVSCNCGKCNTDYSDCIHESIKTNYCTKPQKSYAVGFSI（SEQ ID NO.3），参考其它物种序列分析，设计了大熊猫TSHβ特异序列(TSHβ
‑
1)：VSCNCGKCNTDYSDCIHESIKTNYCTKPQKS（SEQ ID NO.4），并通过人工合成，并与KLH（匙空血蓝蛋白）偶联，作为生产特异性抗体的免疫原（TSHβ
‑1‑
KLH）。
[0018]对于多肽片段的合成，此工艺比较成熟，通过本申请公开的序列，生工生物工程（上海）股份有限公司即可生产出多肽片段TSHβ
‑
1以及免疫原TSHβ
‑1‑
KLH。
[0019]1.2抗原小鼠免疫用佐剂：抗原=1:1的混合液接种，(抗原量不够可与氯化钠混合后再与佐剂乳化)。首免用弗氏完全佐剂，后面免疫用弗氏不完全佐剂。免疫之前准备好灭菌的注射器、三通管、一次性注射器。先用灭菌好的注射器将抗原和NaCl吸进注射器中（共400 μL，四只的量），再用灭菌好的注射器将佐剂吸入注射器中（共400 μL，四只的量）；最后将灭菌好的注射器连在三通管中进行乳化（乳化15分钟，至油包水状态即可），最后再将融合好的混合液转入一次性注射器中进行注射。
[0020]第1天：腹腔注射，200 μL一只。(抗原量为100 μg/只)第14天：腹腔注射，200 μL一只。（之后抗原都为50 μg/只）第21天：腹腔注射，200 μL一只。
[0021]第27天：腹腔注射，200 μL一只。
[0022]第三次免疫后3到4天可小鼠尾部采血，12000 rpm，8 min，取血清测定其效价，以TSHβ
‑
1，包被浓度为2 μg/mL作为抗原，ELISA方法检测血清效价，效价达标后即可准备融合，效价不够高者需继续免疫直至达标。免疫血清效价如表1所示：
表1 免疫后血清效价以上结果表明小鼠达到免疫要求，可进行细胞融合实验。
[0023]1.3细胞融合1.3.1 骨髓瘤细胞（SP2）的复苏：先从液氮中取出冻存好的细胞，快速放于37℃水浴锅中融化，使细胞松散；再将细胞放入15 mL的离心管中，再取大概5 mL的PBS，混匀，1000 rpm、5 min，离心，弃上清，重复两次清洗SP2细胞，将细胞养在培养瓶中，做好标记，最后将培养瓶放入37℃、5% CO2培养箱中培养。
[0024]1.3.2 SP2细胞的传代：当培养瓶中的细胞长满瓶底80%左右，就可进行细胞传代。用枪头将细胞吹打下来，将培养液吸出至15 mL离心管内1000 r/min，离心5分钟；弃上清，加PBS 5 mL，吹打混匀，再次离心弃上本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种大熊猫TSHβ单克隆抗体，其特征在于，其重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。2.根据权利要求1所述的大熊猫TSHβ单克隆抗体，其特征在于，其亚型为IgG1。3.一种表达载体，其特征在于，包括权利要求1或2所述的大熊猫TSHβ单克隆抗体。4.一种分泌如权利要求1或2所述的大熊猫TSHβ单克隆抗体的杂交瘤细胞株TSHB
‑
A，其特征在于，所述杂交瘤...

【专利技术属性】
技术研发人员：蔡开来，王东辉，王涓，胡贤彪，李非平，张梦诗，王神飞，刘玉良，侯蓉，李明喜，兰景超，
申请(专利权)人：成都大熊猫繁育研究基地，
类型：发明
国别省市：