一种用于预防猫传染性腹膜炎的重组蛋白疫苗及其应用制造技术

本发明专利技术公开了一种用于预防猫传染性腹膜炎的重组蛋白疫苗及其应用，属于疫苗技术领域，解决了现有技术中存在的可能导致ADE效应的问题。所述疫苗含有FIPV颗粒的S蛋白中的受体结合结构域RBD，与FIPV颗粒的N和/或M蛋白的氨基酸序列中一段多肽进行重组，所述FIPV颗粒的S蛋白的RBD区域氨基酸位于为S1 domain的541

【技术实现步骤摘要】
一种用于预防猫传染性腹膜炎的重组蛋白疫苗及其应用


[0001]本专利技术属于疫苗
，具体涉及一种用于预防猫传染性腹膜炎的重组蛋白疫苗及其应用。

技术介绍

[0002]猫传染性腹膜炎（Feline Infectious Peritonitis，FIP）是由猫传染性腹膜炎病毒（Feline Infectious Peritonitis Virus，FIPV）引起的一种慢性、渐进性、致死性传染病，以腹膜炎、大量腹水积聚及致死率较高为主要特征。FIPV主要感染0.5~5岁的猫，12月龄以下的猫易感性增强，以纯种猫，多只猫混养及流浪猫更易感。病程可能是突发性（幼猫经常发生）或缓慢性且持续数周。据估计全世界有高达1.4％的猫患FIP死亡。
[0003]FIPV是猫冠状病毒（FCoV）的一种生物型。FCoV属于冠状病毒科，猫舍里有高达90%的猫的体内存在FCoV，在单猫家庭中，也有高达50%的猫的体内存在FCoV；约5%FCoV感染的猫发展为FIP。
[0004]如图1所示，FCoV是一种具有包膜的正链RNA病毒，包含2个非结构基因分别编码复制酶1a和1b；四个结构基因分别编码：刺突蛋白（S）、包膜蛋白（E）、膜蛋白（M）、核衣壳蛋白（N）；5个辅助基因：3a、3b、3c、7a、7b。
[0005]A：FCoV的结构和编码的蛋白质：S、M、E和N。
[0006]B：FCoV单链正义RNA，长约29kb，有11个ORF编码7种非结构蛋白（复制酶蛋白1a和1b，以及辅助蛋白3a、3b、3c、7a、7b）；4种结构蛋白（S、M、E、N）。
[0007]C：S基因。FCoV S基因由两个亚基组成：S1（受体结合结构域，RBD)和S2（融合结构域）。S1亚基分为两个功能域：N
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末端结构域（NTD）和C
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末端结构域（CTD）。S2亚基由融合肽（FP），两个七肽重复序列（HR1和HR2），跨膜结构域（TM）和内结构域（E）组成。两个S激活位点S1/S2和S2'用箭头和虚线表示。
[0008]关于FIP的发病机制科学界曾提出过以下几种理论假说，接受度最高的是内部突变理论和与病毒
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宿主相互作用相关的免疫应答。一种被称为抗体依赖性增强（ADE，antibody
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dependent enhancement）的机制几乎被公认为是FCoV，尤其FIPV，进入细胞的机制。病毒感染都是从黏附于细胞表面开始的，黏附是通过病毒表面蛋白与靶细胞上特异性受体和配体分子的相互作用来完成的。针对病毒表面蛋白的特异性抗体常常可以阻抑这一步骤，将病毒“中和”，使其失去感染细胞的能力；然而在有些情况下，抗体在病毒感染过程中却发挥相反的作用：它们协助病毒进入靶细胞，提高感染率，这一现象就是抗体依赖性增强作用。
[0009]ADE机制运用了宿主的免疫反应，FIPV与抗FIPV的抗体结合，形成感染性的免疫复合物，与细胞表面的Fc受体结合，从而感染细胞。ADE的存在也使得FIP疫苗开发面临巨大的难题。美国硕腾公司曾开发了FIP
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减毒活疫苗，但是上市后发现该疫苗具有潜在诱发FIP的可能性，因此没有继续使用。在近期的研究中，有不少开发FIP疫苗的报道，但是研究发现大多数疫苗通过激活体液免疫发挥作用，反而会诱导产生的病毒中和抗体，容易出现ADE效
应。
[0010]专利CN202110812101公开了一种猫新型冠状病毒亚单位疫苗及其制备方法及应用，本专利技术提供的新型冠状病毒S蛋白的RBD结构域与猫IgG FC结构域融合表达的RBD
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cat Fc蛋白，该亚单位蛋白具有良好的免疫原性，免疫猫后能够诱导高水平抗体，能够用于预防猫感染新型冠状病毒。
[0011]该专利表达的是SARS
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CoV
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2的刺突蛋白受体结合域RBD，主要用于预防猫感染新型冠状病毒，非针对性预防FIP。
[0012]专利CN202110224721公开了一种猫传染性腹膜炎病毒亚单位疫苗及应用，所述疫苗为含有FIPV颗粒的表面蛋白表位序列与铁蛋白经柔性Linker连接后形成的融合蛋白RBD
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FTH。该融合蛋白RBD
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FTH1可通过铁蛋白自行组装作用将RBD
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FTH1单聚体组装成球状二十四聚体纳米颗粒，将RBD区域抗原展示在纳米颗粒表面，能够有效地引起受体更强的免疫反应。本专利技术以FIPV的RBD为抗原片段，并基于铁蛋白实现抗原多聚化，克服了RBD单体免疫抗原性不足的特点，能够有效的引起更强的免疫反应。
[0013]上述专利虽然仅以FIPV颗粒的S蛋白的RBD结构作为抗原，相比减毒活疫苗的S蛋白全段诱导ADE效应有所减弱，但是仍以激活体液免疫为主，存在ADE效应风险。
[0014]核酸疫苗，如mRNA疫苗，为内源性物质，主要通过MHC
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呈递途径，激活细胞免疫，最大程度降低ADE效应，但是研发和生产成本高。
[0015]专利CN202210001302公开了一种用于预防猫传染性腹膜炎的mRNA疫苗及其制备方法与应用。该mRNA编码具有较强免疫原性的S蛋白和/或E蛋白，以及这两个蛋白中至少一个蛋白的片段，使mRNA递送至体内后能够在机体内表达S蛋白和/或E蛋白，或作为抗原的S蛋白和E蛋白的至少一个片段，有效触发机体的免疫反应，可用于制备预防猫传染性腹膜炎的mRNA疫苗。
[0016]已有研究表明，细胞免疫在预防FIP发病中发挥了重要作用，通过T辅助细胞（Th1细胞）活性的增强，刺激分泌IL
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2（白介素
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2）、IFN
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γ（干扰素γ）等细胞因子，诱导CD8+T细胞应答，产生细胞毒性效应，从而杀伤清除胞内病毒。激活细胞免疫的前提是抗原提呈细胞摄取抗原，再以抗原肽
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MHC分子复合物的形式将抗原提呈给Th1细胞。Th1细胞对抗原的识别，实际上识别的是抗原中的某一段多肽表位。
[0017]科学家从FIPV颗粒的N和M结构蛋白中鉴定出可以强烈诱导Th1细胞活性的多肽（a.Screening and identification of T helper 1 and linear immunodominant antibody
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binding epitopes in the spike 2 domain and the nucleocapsid protein of feline infectious peritonitis virus；doi:10.1016/j.vaccine.2010.12.106. b. Screening and identification of T helper 1 and linear immunodominant antibody
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【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种用于预防猫传染性腹膜炎的重组蛋白疫苗，其特征在于：所述疫苗含有FIPV颗粒的S蛋白中的受体结合结构域RBD，与FIPV颗粒的N和/或M蛋白的氨基酸序列中一段多肽进行重组。2.根据权利要求1所述的一种用于预防猫传染性腹膜炎的重组蛋白疫苗，其特征在于：所述FIPV颗粒的S蛋白的RBD区域氨基酸位于为S1 domain的541
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695，在RBD区域氨基酸前端添加信号肽，后端添加三聚体domain的结构域，氨基酸序列如SEQ ID NO: 1所示。3.根据权利要求2所述的一种用于预防猫传染性腹膜炎的重组蛋白疫苗，其特征在于：利用昆虫细胞
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杆状病毒表达系统进行所述的S蛋白的受体结合结构域氨基酸序列的克隆表达。4.根据权利要求1所述的一种用于预防猫传染性腹膜炎的重组蛋白疫苗，其特征在于：FIPV颗粒的N蛋白中的一段多肽采用固态合成方式得到，所述的FIPV颗粒的N蛋白中的一段多肽氨基酸序列，如SEQ ID NO:...

【专利技术属性】
技术研发人员：张凌，屈梦珂，韩剑锋，张志荣，
申请(专利权)人：成都导飞科技有限公司，
类型：发明
国别省市：