一种IRAK4表达量的测量方法技术

本发明专利技术公开了白介素1受体相关激酶4(IRAK4)的sMRM靶向测量方法及其应用。该方法通过检测IRAK4的标志性肽段(具有唯一性)的含量来代表IRAK4蛋白的表达量；所述的IRAK4的两个独立的标志性肽段序列为：GYVNNTTVAVK和TANTLPSK，包括步骤：细胞样品蛋白质的前处理，sMRM方法开发，临床细胞样品样本中IRAK4的sMRM检测与数据分析。该方法可用于评估以IRAK4为药物靶点开发的PROTAC，小分子抑制剂等多种形式药物对IRAK4蛋白的降解量即药效的评价；定量细胞/血浆等多种类型生物样本中IRAK4蛋白含量辅助炎症性疾病的诊断、检测、病程监测以及预后评估等。程监测以及预后评估等。

【技术实现步骤摘要】
一种IRAK4表达量的测量方法


[0001]本专利技术属于生物医药
，涉及一种IRAK4表达量的测量方法，具体涉及细胞样品中IRAK4的sMRM测定方法，尤其适用于细胞样品中炎症性疾病相关蛋白的绝对含量测定。

技术介绍

[0002]白介素1受体相关激酶4(Interleukin1 Receptor Associated Kinase4，IRAK4)是由IRAK4基因编码的蛋白，全长460个氨基酸，属胞质蛋白，是一种丝氨酸/苏氨酸激酶，位于白介素(IL)
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1家族受体和Toll样受体(TLR)信号传导之间的交叉点。通过Toll样受体或某些白细胞介素受体介导的固有免疫反应，是机体对外来抗原最初防御的重要介质，而它们的失调与癌症的发生和进展相关。TLRs和IL
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1受体(IL
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1R)家族信号通过适配蛋白MYD88，导致IRAK4的组装和激活，启动信号级联传导，诱导转录因子NF
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κB介导的细胞因子和生存因子表达。最近，人们认识到TLR/IL
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1R通路中蛋白质的突变都可能导致过度活跃的信号和增加NF
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κB活性，并促进癌症。多年来，一方面研究人员将IRAK4活性与炎症和免疫疾病联系起来，包括关节炎、动脉粥样硬化、阿尔茨海默病、痛风、系统性红斑狼疮、牛皮癣等。另一方面发现IRAK4是TLR/IL
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1R下游信号通路的主要调节因子，其过度激活，或者因为突变异常激活，参与炎症性疾病和肿瘤的发生和发展，因此IRAK4在免疫疾病和肿瘤治疗领域被认为是一个非常具有潜力的药物靶点。在模式动物中敲除或降低IRAK4活性，能够缓解小鼠免疫性疾病，包括感染性休克，系统性红斑狼疮，急性肝损伤，心血管疾病及阿尔茨海默；在AML细胞的非临床实验中，CA
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4948抑制IRAK4
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L激酶活性，可消除白血病的生长。大量研究表明，开发去除IRAK4蛋白降解药物可以为多种疾病适应症提供治疗机会。开发样本如血清/基质中IRAK4的检测方法将有利于自身免疫性疾病，癌症，还包括化脓性汗腺炎、特应性皮炎、慢性肾病、酒渣鼻、盆腔炎、新冠病毒感染、脓毒症等领域的研究者
①
评估以IRAK4为药物靶点开发的PROTAC，小分子抑制剂等多种形式药物对IRAK4蛋白的降解量即药效的评价
②
定量细胞/血浆等多种类型生物样本中IRAK4蛋白含量辅助炎症性疾病的诊断、检测、病程监测以及预后评估等。

技术实现思路

[0003]为了解决现有技术存在的不足，本专利技术的目的是提供一种白介素1受体相关激酶4(Interleukin1 Receptor Associated Kinase4,IRAK4)表达量的测量方法，具体涉及生物样品中IRAK4的质谱动态多反应监测模式(sMRM)测定方法。本专利技术所述方法适用于药物处理前后生物样品中IRAK4蛋白的绝对含量测定。
[0004]针对上述技术问题，本专利技术提供了一种生物样品中IRAK4表达量的测量方法，该方法是基于对IRAK4的两个独立的标志性肽段的质谱靶向定量检测。本专利技术的针对IRAK4的sMRM检测不仅可应用于细胞样品中IRAK4的定量检测，也可应用于其他临床以及科研模型样本例如组织样品、血清样品、血浆样品、尿液样品中IRAK4蛋白的定量检测。本专利技术在上述
基础上完成。
[0005]本专利技术提供了一种IRAK4表达量的测量方法，通过检测IRAK4的标志性肽段(具有唯一性)的含量来代表IRAK4蛋白的表达量；所述的IRAK4的标志性肽段的序列为GYVNNTTVAVK(SEQ ID NO.1)和TANTLPSK(SEQ ID NO.2)。
[0006]具体而言，本专利技术的测量方法包括以下步骤：(1)细胞样品蛋白质的前处理，具体程序包括细胞样品的收集，蛋白的提取，蛋白的还原烷基化与酶解；(2)质谱的sMRM方法开发，具体包括IRAK4蛋白标志性肽段的设计包括符合胰蛋白酶酶切规律、选择不含半胱氨酸、不含蛋氨酸以及不含漏切位点的肽段，同位素内标肽的合成，监测母子离子对的筛选以及LC
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MS/MS(Liquid chromatography
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tandem mass spectrometry)条件的优化；(3)细胞样品样本中IRAK4的sMRM检测与数据分析。
[0007]本专利技术中使用的所述的测量方法包括使用质谱测定，获得人血浆中最低检出限为1ng/ml，在人细胞中最低检出限为1ng/ml。
[0008]本专利技术中可选用的质谱为三重四级杆质谱(SCIEX Triple Quad
TM
6500+)。
[0009]其中，使用的质谱模式为动态多反应监测模式(sMRM)。
[0010]所述质谱模式中，所述动态多反应监测模式(sMRM)是指通过确定保留时间后，质谱自动的将相应的驻留时间给到相应的离子对使得响应值提高，同时可以确保在预计的循环时间内。
[0011]进一步地，所述的IRAK4的标志性肽段是序列为GYVNNTTVAVK(SEQ ID NO.1)和TANTLPSK(SEQ ID NO.2)的轻标内标肽和序列相同并且被同位素标记的重标内标肽。
[0012]所述的重标内标肽是指肽链中的一个或多个氨基酸残基被含有一种或多种同位素标记的、与SEQ ID NO.1所示序列相同的多肽。
[0013]所述的标志性肽段中，序列为GYVNNTTVAVK(SEQ ID NO.1)的肽段的分子量为1164.4，序列为TANTLPSK(SEQ ID NO.2)的肽段的分子量为831.0，标志性肽段中序列为GYVNNTTVAVK(SEQ ID NO.1)和TANTLPSK(SEQ ID NO.2)的肽段在离子源中主要呈现二价态。
[0014]所述的重标内标肽中，序列为GYVNNTTVAVK(SEQ ID NO.1)的肽段的分子量为1182.6，二价肽质荷比为592.3；序列为TANTLPSK(SEQ ID NO.2)的肽段的分子量为850.0，二价肽质荷比为426.0，重标内标肽中序列为GYVNNTTVAVK(SEQ ID NO.1)和TANTLPSK(SEQ ID NO.2)的肽段在离子源中主要呈现二价态。
[0015]本专利技术通过质谱方法测定来自细胞样品中蛋白质消化物的IRAK4的肽段片段的含量；所述的表达量是指样品之间的相对含量或者绝对含量。
[0016]所述的蛋白质消化物包括蛋白酶消化物或者胰蛋白酶消化物。
[0017]其中，用于检测IRAK4表达量的生物样品包括(对照或者药物处理后)细胞样品、组织样品、血清样品、血浆样品、尿液样品。
[0018]本专利技术中的测量方法通过sMRM检测样品中IRAK4的标志性肽段的sMRM特征峰面积以及掺入样品中浓度已知的重标同位素内标肽的sMRM特征峰面积性，对比两者峰面积的比例，即可计算出本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种IRAK4表达量的测量方法，其特征在于，所述的测量方法包括以下步骤：细胞样品蛋白质的前处理，sMRM方法开发，样本中IRAK4的sMRM检测与数据分析；具体步骤为通过检测IRAK4的标志性肽段的含量来代表IRAK4蛋白的表达量；所述的IRAK4的两个独立的标志性肽段序列为GYVNNTTVAVK和TANTLPSK。2.如权利要求1所述的测量方法，其特征在于，所述的测量方法包括使用质谱测定。3.如权利要求2所述的测量方法，其特征在于，所述的质谱为三重四级杆质谱(SCIEX Triple Quad
TM
6500+)；所述的质谱采用的模式是动态多反应监测模式sMRM。4.如权利要求1所述的测量方法，其特征在于，所述的IRAK4的标志性肽段是指序列为GYVNNTTVAVK和TANTLPSK的轻标内标肽和序列相同并且被同位素标记的重标内标肽。5.如权利要求4所述的测量方法，其特征在于，所述的重标内标肽包括一个或多个氨基酸残基被含有一种或多种同位素标记的与GYVNNTTVAVK和TANTLPSK所示序列相同的多肽；所述的重标内标肽的二价肽质荷比为592.3、426.0，与内源标志性肽段的分子量相差至少9Da。6.如权利要求1所述的测量方法，其特征在于，所述的标志性肽段序列为GYVNNTTVAVK和TANTLPSK的分子量分别为1164.4、831.0。7.如权利要求1所述的测量方法，其特征在于，所述的测量方法检测来自细胞中蛋白质消化物的IRAK4的肽段片段的含量，所述的表达量是指相对含量或者绝对含量。8.如权利要求7所述的测量方法，其特征在于，所述的蛋白质消化物包括蛋白酶消化物或者胰蛋白酶消化物。9.如权利要求1所述的测量方法，其特征在于，用于检测IRAK4表达量的生物样品包括对照或者药物处理后细胞样品、组织样品、血清样品、血浆样品、尿液样品。10.如权利要求1所述的测量方法，其特征在于，所述的测量方法是通过sMRM检测样品...

【专利技术属性】
技术研发人员：王姗，汪泽海，彭章晓，方后琴，沈伽西，舒烈波，
申请(专利权)人：上海鹿明生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：