通过基因编辑OsbZIP48和OsbZIP50制备高效富集锌铁铜元素的水稻材料的方法技术

本发明专利技术公开了一种通过基因编辑OsbZIP48和OsbZIP50制备高效富集锌铁铜元素的水稻材料的方法，产生CHR结构域中保守氨基酸缺失并功能获得的不含载体序列的水稻材料，该水稻材料能持续性激活下游锌、铁、铜元素吸收利用相关基因的表达，并在营养组织及糙米中富集更多的锌、铁、铜元素；或产生bZIP结构域缺失并功能丢失的不含载体序列的水稻材料，该材料缺锌条件下生长发育受阻、下游锌、铁、铜元素吸收利用相关基因的表达下降，营养组织中锌、铁、铜元素含量下降。本发明专利技术提供的基因编辑水稻材料具有很高的应用价值，能够明显改良水稻对锌、铁、铜元素的吸收能力以及水稻糙米中锌、铁、铜等微量元素含量。量元素含量。量元素含量。

【技术实现步骤摘要】
通过基因编辑OsbZIP48和OsbZIP50制备高效富集锌铁铜元素的水稻材料的方法


[0001]本专利技术涉及基因工程
，具体涉及一种通过基因编辑OsbZIP48和OsbZIP50制备高效富集锌铁铜元素的水稻材料的方法。

技术介绍

[0002]锌(Zn)是植物中最重要的必需元素之一，是植物中许多酶和调节蛋白的辅因子，在超氧化物自由基的解毒、维持膜完整性以及介导酶反应、转录因子的DNA结合和蛋白质
‑
蛋白质相互作用中发挥重要作用。土壤中的锌缺乏现象普遍存在，它降低了作物产量和品质以及营养价值。锌也是动物和人的必须微量元素之一，缺锌影响智力发育和人体健康。铁(Fe)和铜(Cu)也是植物和动物以及人的必须元素，缺铁和缺铜会导致贫血等症状。因此，在现代作物育种计划中，应将培育对缺锌土壤具有更高耐受性的作物品种以及种子中富含锌铁等微量元素的作物品种列入议程。
[0003]在过去的几十年里，已经在植物中发现了锌稳态的几种调控机制，其中包括从土壤中获取和吸收锌，锌通过质膜或细胞器膜的细胞内运输，以及锌在不同组织/器官之间的转运。其中，锌调节转运蛋白、铁调节转运蛋白(ZRT
‑
IRT)样蛋白(ZIP)家族转运蛋白是高度保守的转运蛋白，负责植物对Zn
2+
、Fe
2+
和Cu
2+
等元素的吸收、细胞内转运和解毒。在水稻(Oryza Sativa，L)中，ZIP家族有16个成员，但迄今为止只有少数成员的功能被鉴定。其中OsZIP4和OsZIP8的表达量受到缺锌条件诱导上调，对其过度表达和突变植株的分析表明，它们都参与水稻植株对锌的吸收和分配。
[0004]OsbZIP48和OsbZIP50属于F亚家族的bZIP转录因子。这些F组bZIP转录因子具有一个保守的N末端区域，该区域富含半胱氨酸和组氨酸残基(CHR)，以及一个保守的C末端区bZIP结构域，该区域介导二聚体形成以及进入细胞核与下游基因启动子DNA结合，调控下游基因表达。。

技术实现思路

[0005]本专利技术提供一种通过基因编辑OsbZIP48和OsbZIP50制备高效富集锌铁铜元素的水稻材料的方法，为一种基因OsbZIP48与OsbZIP50在改良水稻对锌、铁、铜元素富集能力方面的应用及获得的水稻高效富集锌、铁、铜元素基因，通过基因组编辑技术获得不含转基因载体的锌、铁、铜元素富集能力增强的水稻材料。
[0006]本专利技术通过CRISPR
‑
Cas9基因编辑转录因子OsbZIP48与OsbZIP50的编码区序列，产生bZIP48基因CHR结构域中部分氨基酸缺失的，在旗叶和糙米中均富集更多锌、铁、铜元素的，不含载体序列的水稻材料的应用，以及获得的能增强水稻锌等元素吸收利用能力的OsbZIP48突变形式的基因。或产生OsbZIP48与OsbZIP50的bZIP结构域缺失并功能丢失的不含载体序列的水稻材料，该材料缺锌条件下生长发育受阻、下游锌、铁、铜元素吸收利用相关基因的表达下降，营养组织中锌、铁、铜元素含量下降。
[0007]本专利技术是利用水稻bZIP家族转录因子两个功能冗余的基因OsbZIP48与OsbZIP50改良水稻富集锌、铁、铜元素能力的应用。本专利技术提供的OsbZIP48与OsbZIP50基因分别是水稻第6号染色体和5号染色体上的bZIP家族转录因子基因，基因编号为Os06g0716800和Os05g0495200(RAP编号)或LOC_Os06g50310和LOC_Os05g41540(MSU编号)。
[0008]OsbZIP48的基因组DNA全长3785bp，共含有1个外显子，序列如SEQ ID NO.1所示，其结构图见图1。OsbZIP48基因编码区CDS全长为819bp，序列如SEQ ID NO.2所示；OsbZIP48基因编码272个氨基酸，具体序列如SEQ ID NO.3所示。OsbZIP48蛋白在N端含有两个CHR结构域(cysteine
‑
and histidine
‑
rich domain)，在C端含有一个bZIP结构域(bZIP domain)，具体见图1所示。
[0009]OsbZIP50的基因组DNA 全长1782bp，共含有1个外显子，序列如SEQ ID NO.4所示，其结构图见图1。OsbZIP50基因编码区CDS全长为675bp，序列如SEQ ID NO.5所示；OsbZIP50基因编码224个氨基酸，具体序列如SEQ ID NO.6所示。OsbZIP50蛋白在N端含有两个CHR结构域(cysteine
‑
and histidine
‑
rich domain)，在C端含有一个bZIP结构域(bZIP domain)，具体见图1所示。
[0010]本专利技术提供一种利用OsbZIP48与OsbZIP50基因改良水稻富集锌、铁、铜元素的应用，具体为：
[0011]设计OsbZIP48与OsbZIP50基因的sgRNA，具体为：OsbZIP48
‑
sgRNA
‑
F，OsbZIP48
‑
sgRNA
‑
R，OsbZIP50
‑
sgRNA
‑
F，OsbZIP50
‑
sgRNA
‑
R；构建CRISPR/Cas9载体。
[0012]本专利技术提供设计并合成sgRNA所需的前导序列(GuideSequence)，其序列碱基为：
[0013]OsbZIP48
‑
sgRNA
‑
F 5
‑
GGACGATCTTGGTGTGGACA
‑
3 20mer(SEQ ID NO.7)
[0014]OsbZIP48
‑
sgRNA
‑
R 5
‑
TGTCCACACCAAGATCGTCC
‑
3 20mer(SEQ ID NO.8)
[0015]OsbZIP50
‑
sgRNA
‑
F 5
‑
GGGACCTGACGAAGACCCGG
‑
3 20mer(SEQ ID NO.9)
[0016]OsbZIP50
‑
sgRNA
‑
R 5
‑
CCGGGTCTTCGTCAGGTCCC
‑
3 20mer(SEQ ID NO.10)
[0017]将OsbZIP48
‑
sgRNA
‑
F和OsbZIP48
‑
sgRNA
‑
R、OsbZIP50
‑
sgRNA
‑
F和OsbZIP50
‑
sgRNA
‑...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种通过基因编辑OsbZIP48制备高效富集锌铁铜元素的水稻材料的方法，其特征在于，包括以下步骤：通过CRISPR
‑
Cas9基因编辑技术，针对基因OsbZIP48的CHR结构域设计特异sgRNA序列，使OsbZIP48转录因子CHR结构域中保守碱基缺失，获得OsbZIP48基因突变的突变体水稻材料，即为高效富集锌铁铜元素的水稻材料。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的基因OsbZIP48的碱基序列如SEQ ID NO.1所示。3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的特异sgRNA序列为：OsbZIP48
‑
sgRNA
‑
F：5
‑
GGACGATCTTGGTGTGGACA
‑
3；OsbZIP48
‑
sgRNA
‑
R：5
‑
TGTCCACACCAAGATCGTCC
‑
3。4.一种水稻锌、铁、铜元素富集基因，其特征在于，其碱基序列如SEQ ID NO.23所示。5.一种水稻锌、铁、铜元素富集基因编码的蛋白质，其特征在于，其氨基酸序列如SE...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘建祥，卿涛，
申请(专利权)人：浙江大学，
类型：发明
国别省市：