本发明专利技术涉及生物化学中核酸检测技术领域，提供一种用以核酸检测的通用型胶体金侧流层析试纸条的制备方法和应用，所述胶体金侧流层析试纸条包括PVC板、金标垫、样品垫、硝酸纤维素膜以及吸水垫；所述金标垫上包被金标抗体，所述硝酸纤维素膜上分别画有C线和T线，所述C线和T线分别包被链霉亲和素和单克隆山羊抗兔IgG。本发明专利技术成功制作出通用型胶体金侧流层析试纸条，其制作简单、成本低，适合家庭化核酸自测，且利用本发明专利技术的试纸条可以实现快速、准确的HPV16核酸检测，在35min之内可以清楚观察到检测结果。检测结果。检测结果。
【技术实现步骤摘要】
一种用以核酸检测的通用型胶体金侧流层析试纸条的制备及其应用
[0001]本专利技术涉及生物化学中核酸检测
，提供一种用以核酸检测的通用型胶体金侧流层析试纸条的制备方法和应用。
技术介绍
[0002]侧流免疫层析是一种基于抗原、抗体免疫反应的经典床旁检测技术(point of care testing，POCT)，常见的标记材料包括胶体金、量子点、时间分辨荧光微球、上转换纳米颗粒、磁性纳米颗粒等，其中最经典的一种标记检测技术是胶体金免疫层析技术，该免疫层析技术依靠大量金纳米颗粒的聚集形成肉眼可见的色带。但传统依赖抗原抗体的胶体金免疫层析试纸条检测灵敏度低，而且存在检测窗口期。而核酸检测胶体金侧流层析试纸条结合等温扩增
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CRISPR/Cas12a分子诊断技术可以提高核酸检测灵敏度和特异性，同时通过优化试纸条检测F
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B探针的浓度，可以在保证试纸条检测可行性的同时缩短CRISPR/Cas12a反应时间，实现超快速核酸检测。且胶体金侧流层析试纸条的制作简单、成本低、检测结果肉眼可见，可以用于检测人类和动物的病原体感染或生物标志物，在核酸即时快速检测方面发挥着不可替代的作用，因此制备胶体金层析试纸条是实现核酸即时的关键。
技术实现思路
[0003]为了提高核酸检测的效率，本专利技术提供一种核酸检测的通用型胶体金侧流层析试纸条、制备方法以及应用。
[0004]本专利技术提供了一种通用型核酸检测胶体金侧流层析试纸条，其依次包括PVC板、金标垫、样品垫、硝酸纤维素膜(NC膜)以及吸水垫：
[0005]进一步，所述金标垫为玻璃纤维素膜；
[0006]进一步，所述玻璃纤维素膜、样品垫用处理液浸泡，并自然风干；
[0007]进一步，所述处理液为1％BSA、5％蔗糖、0.5％Tween
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20、10mM PB缓冲液，pH为7.4；
[0008]进一步，所述玻璃纤维素膜包被胶体金颗粒标记的单克隆小鼠抗荧光素抗体(金标抗体)；所述NC膜上按照样品层析方向依次设置控制线(C线)和检测线(T线)，所述C线上包被链霉亲和素，所述T线上包被单克隆山羊抗兔IgG；
[0009]本专利技术提供了一种核酸检测的通用型胶体金侧流层析试纸条的制备方法：
[0010](1)制备金标垫；
[0011](2)制备NC膜上的质控线和检测线；
[0012](3)组装胶体金侧流层析试纸条；
[0013](4)胶体金侧流层析试纸条性能测试。
[0014]进一步，步骤(4)中，所述胶体金侧流层析试纸条性能测试，包括：
[0015](1)显色验证
[0016]用不同浓度的荧光探针F
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B模拟阴性检测样本，滴在试纸条上进行测试，查看在相同时间内试纸条上C线和T线的颜色深浅，并拍照记录。
[0017](2)稳定性验证
[0018]将同一批次的试纸条装入含有干燥剂的塑封袋里，放置在常温环境中保存，保存不同时间后进行显色验证；
[0019]本专利技术提供了一种通用型胶体金侧流层析试纸条在检测人乳头瘤病毒16型(HPV16)中的应用：
[0020]以HPV16L1基因重组质粒为模板，采用恒温扩增引物扩增目标片段，得到特异性扩增产物；特异性扩增产物加入到CRISPR/Cas12a反应体系中，进行恒温反应，反应体系通过侧流层析试纸条进行检测。
[0021]本专利技术的优点在于：
[0022]本专利技术制作了一种通用型胶体金侧流层析试纸条可用来检测核酸，其制作简单，无需任何仪器，成本低，适合家庭化核酸自测。
附图说明
[0023]图1为本专利技术的胶体金侧流层析试纸条组装结构示意图；
[0024]图2为本专利技术的胶体金侧流层析试纸条组装实物图；
[0025]图3为本专利技术的胶体金侧流层析试纸条显色验证结果，从左到右F
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B探针的终浓度为1nM、2nM、5nM、10nM、20nM、30nM、40nM、50nM；
[0026]图4为本专利技术的胶体金侧流层析试纸条稳定性测试结果；
[0027]图5为本专利技术的胶体金侧流层析试纸条检测HPV16结果图；
[0028]附图标记说明
[0029](1)PVC基板；(2)样品垫；(3)金标垫；(4)硝酸纤维素膜；(5)吸水垫；(6)C线；(7)T线。
具体实施方式
[0030]下面将结合本专利技术实施例对本专利技术的具体实施方式做出说明。若未特别指明，下述实施例以及实验例所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段，且所用的材料、试剂等，均可从商业途径得到。
[0031]实施例1提供了一种通用型胶体金侧流层析试纸条：
[0032]通用型胶体金侧流层析试纸条包括PVC板、金标垫、样品垫、硝酸纤维素膜(NC膜)以及吸水垫，样品垫和吸水垫的长度为1.7cm，金标垫的长度我0.8cm，NC膜长度为2.4cm，PVC板长度为6cm，宽度都是3mm，结构示意图如图1所示。金标垫为玻璃纤维素膜，玻璃纤维素膜、样品垫用处理液(1％BSA、5％蔗糖、0.5％Tween
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20、10mM PB缓冲液，pH为7.4)浸泡，并自然风干。
[0033]在本实施例中，玻璃纤维素膜上包被金标抗荧光素抗体，NC膜上设有C线和T线，C线上包被链霉亲和素，T线上包被山羊抗兔IgG。
[0034]当有目标核酸序列时，经过恒温扩增
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CRISPR/Cas12a反应，F
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B探针被切割，探针两端修饰的生物素和荧光素分离，将制备的胶体金侧流层析试纸条插入上述反应溶液中进
行检测；由于探针被切割，C线的链霉亲和素无法通过生物素捕获到金标抗体，从而C线没有颜色，T线的IgG抗体与金标抗体结合显示出红色。
[0035]当无目标核酸序列时，经过恒温扩增
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CRISPR/Cas12a反应，F
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B探针不被切割，生物素和荧光素不会分离，C线的链霉亲和素通过生物素捕获到金标抗体，从而C线有颜色，多余的金标抗体与T线的山羊抗小鼠IgG抗体结合显示出红色。所以，有待测靶标时，只有T线；无待测靶标时，C线和T线同时出线；若试纸条T线未出，则该试纸条失效。
[0036]实施例2提供了一种通用型胶体金侧流层析试纸条的制作方式，具体步骤为：
[0037](1)制备金标垫：将玻璃纤维素膜浸泡到含有金标抗体的卡槽里，37℃烘干后得到金标垫，用锡纸包裹放置在室温备用；
[0038](2)制备NC膜上的质控线和检测线：用钢笔吸取链霉亲和素和单克隆山羊抗兔IgG分别划在NC膜上，得到包含有C线和T线的NC膜，37℃烘干，用锡纸包裹放置在室温备用；
[0039](3)组装胶体金侧流层析试纸条；依次将NC膜、金标垫、吸水垫、样品垫粘贴在PVC板上，裁剪成3mm宽度的试纸条放置到封口袋中备用，如图2所示；
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【技术保护点】
【技术特征摘要】
1.一种用以核酸检测的通用型胶体金侧流层析试纸条，其特征在于，所述胶体金侧流层析试纸条包括PVC板、金标垫、样品垫、NC膜以及吸水垫。所述金标垫是包含胶体金颗粒标记的单克隆小鼠抗荧光素抗体(金标抗体)的玻璃纤维素膜；所述NC膜上按照样品层析方向依次设置C线和T线，所述C线上包被链霉亲和素，所述T线上包被单克隆山羊抗兔IgG。2.根据权利要求1所述的通用型胶体金侧流层析试纸条，其特征在于，所述玻璃纤维素膜和样品垫用处理液浸泡之后自然风干。3.根据权利要求2所述玻璃纤维素膜和样品垫的处理方式，其特征在于，处理液为1％BSA、5％蔗糖、0.5％Tween
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20、10mM PB缓冲液，pH为7.4。4.根据权利要求1所述的通用型胶体金侧流层析试纸条，具体制备方式如下：(1)制备金标垫：将玻璃纤维素膜浸泡到含有金标抗体的卡槽里，37℃烘干后得到金标垫，用锡纸包裹放置在室温备用；(2)制备NC膜上的C线和T线：用钢笔吸取链霉亲和素和单克隆山羊抗兔IgG分别画在NC膜上，得到包含有C线和T线的NC膜，37℃烘干，用锡纸包裹放置在室温备用；(3)组装胶体...
【专利技术属性】
技术研发人员：王铁，刘梅，杜以晨，
申请(专利权)人：天津理工大学，
类型：发明
国别省市：
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