一种应用于定量蛋白质组学研究的双稀土金属标记肽段合成及定量新方法技术

本发明专利技术公开了一种双稀土金属标记肽段合成及定量新方法，应用于定量蛋白质组学的研究。该方法通过在一定条件下，将DOTA精确合成到肽段特殊位点的方式，实现肽段的双重稀土金属标记。肽段可以通过标记的稀土金属实现精准的相对定量。本发明专利技术突破了现有几类常用定量标记的技术瓶颈，在扩大标记选材库的同时保证了标记效率，降低了标记成本与时间成本，为定量蛋白质组学提供了大规模高通量鉴定的新方法，对生物医学及药物化学领域中的差异蛋白质组或比较蛋白质组分析起到了极大的支撑作用。或比较蛋白质组分析起到了极大的支撑作用。

【技术实现步骤摘要】
一种应用于定量蛋白质组学研究的双稀土金属标记肽段合成及定量新方法


[0001]本专利技术属于定量蛋白质组学
，具体涉及一种应用于定量蛋白质组学研究的双稀土金属标记肽段合成及定量新方法。

技术介绍

[0002]随着基因组学和蛋白质组学的发展，基于液质联用的目标蛋白质组定量技术已经成为常用的蛋白质定量手段。在定量蛋白质组学中，稳定同位素标记技术将轻、重同位素差异纳入两个或多个样品中，被广泛应用于蛋白质组差异的全面分析。其中，SILAC、TMT、iTRAQ等标记方式受到了大规模的应用。然而，该类标记方式受到了同位素试剂合成困难、价格高昂、定量动态范围有限以及存在“压缩效应”等因素的制约。
[0003]相较于稳定同位素标记技术，金属标记技术是使用金属元素代替同位素试剂，通过相似的反应路线为样品添加化学标签，实现目标蛋白质组定量的目的。金属标记技术具有原材料易制得、价格低廉、金属选择供体种类繁多等诸多优点。使用化学性质相近的金属元素进行标记，可使不同金属标记的同一肽段在色谱中的保留时间及在质谱中的碎裂行为、信号响应都非常接近，有利于蛋白质组学定量的研究。因此，稀土金属由于其外源性、稳定性以及相互间相似的化学性质成为理想的标记物。然而，使用单稀土金属标记肽段，无法提高混合样品的上样规模，实现高通量定量蛋白质组。
[0004]综上所述，目前金属标记肽段的方法还不能满足高通量定量蛋白质组的要求，有必要开发更好的方法。

技术实现思路

[0005]本专利技术的目的是提供一种应用于定量蛋白质组学研究的双稀土金属标记肽段合成及定量新方法。
[0006]本专利技术所提供的一种双稀土金属标记肽段合成的新方法，通过更改标记金属的种类，实现混合样品的高通量定量鉴定。
[0007]本专利技术的方法是使用两种相同或不同的稀土金属对C端带有赖氨酸的肽段进行标记。
[0008]具体方法包括下述步骤：
[0009]1)使用DOTA
‑
NHS
‑
ester试剂对目的肽段的N端氨基通过脱水缩合反应进行修饰，所述DOTA
‑
NHS
‑
ester的结构式如下式1所示：
[0010][0011]2)将稀土元素氯化物加入到步骤1)DOTA
‑
NHS
‑
ester修饰后的肽段溶液中，得到单稀土金属标记肽段；
[0012]3)使用DOTA
‑
NHS
‑
ester试剂对步骤2)得到的单稀土金属标记肽段的C端赖氨酸通过脱水缩合反应进行修饰；
[0013]4)将稀土元素氯化物加入到步骤3)制备的肽段溶液中，得到双稀土金属标记肽段。
[0014]上述方法步骤1)中，所述反应的条件如下：肽段与DOTA
‑
NHS
‑
ester物质的量比为1:10
‑
1:1000(优选1:100)，pH为9.0
‑
9.4，温度为4～37℃，时间为0.5～6h。
[0015]上述方法步骤1)中，所述DOTA
‑
NHS
‑
ester溶于无水乙腈，配置成10mM
‑
50mM溶液，优选25mM；所述肽段溶于三乙胺
‑
碳酸缓冲溶液(TEAB缓冲液)，配置成10mM
‑
50mM溶液，优选25mM(pH 9.2)。
[0016]上述方法步骤1)中，所述反应的反应体系中水与乙腈的体积比为1:1
‑
1:10，优选的，使用1:3作为反应条件。
[0017]上述方法步骤2)中，所述DOTA
‑
NHS
‑
ester修饰后的肽段溶液是将DOTA
‑
NHS
‑
ester修饰后的肽段溶于0.1M的醋酸铵缓冲溶液(pH 5.6)中得到的。
[0018]上述方法步骤2)中，所述反应的条件如下：DOTA
‑
NHS
‑
ester与稀土元素氯化物的物质的量比为1:1
‑
1:10(优选1:5)，温度为4～37℃，时间为0.5～6h。
[0019]上述方法步骤3)中，所述反应的条件如下：肽段与DOTA
‑
NHS
‑
ester物质的量比为1:10
‑
1:1000(优选1:100)，pH为8.3
‑
8.7，温度为4～37℃，时间为0.5～6h。
[0020]上述方法步骤3)中，所述DOTA
‑
NHS
‑
ester溶于无水乙腈，配置成10mM
‑
50mM溶液，优选25mM；所述肽段溶于三乙胺
‑
碳酸缓冲溶液(TEAB缓冲液)，配置成100mM溶液(pH 8.8)。
[0021]上述方法步骤3)中，所述反应的反应体系中水与乙腈的体积比为1:1
‑
1:10，优选的，使用1:3作为反应条件。
[0022]上述方法步骤4)中，所述步骤3)制备的肽段溶液是将步骤3)制备的肽段溶于0.1M的醋酸铵缓冲溶液(pH 5.6)中得到的。
[0023]上述方法步骤4)中，所述反应的条件如下：DOTA
‑
NHS
‑
ester与稀土元素氯化物的物质的量比为1:1
‑
1:10，优选1:5，温度为4～37℃，时间为0.5～6h。
[0024]本专利技术中所述C端带有赖氨酸的肽段的样本来源可以是组织、细胞、蛋白以及标准合成肽段。
[0025]来源于组织、细胞、蛋白样品的肽段的制备方法如下：通过常规方法对组织或细胞进行裂解获得产物，并使用蛋白内切酶Lys
‑
C对产物进行酶切，得到C端带有赖氨酸的肽段混合物。
[0026]所述标准合成肽段，如标准合成肽段DVDPGEHYIIK，其结构如下所示：
[0027]上述方法中，所述稀土金属可为铽、钬、镱、镝、铒、铥。
[0028]上述方法步骤2)和步骤3)中，所述稀土金属氯化物中的稀土金属可以相同或不同。
[0029]上述方法还包括下述步骤：
[0030]4)合成肽段的鉴定及标记效率的计算
[0031]用MALDI
‑
TOF MS对标记结果进行鉴定验证，并计算稀土金属双标记的标记效率；
[0032]5)双标记样本的质谱定量
[0033]使用LC
‑
MS/MS对双标记样本进行质谱检测，对肽段进行鉴定与定量，并进行质谱数据解析及蛋白质鉴定。
[0034]上述方法制备得到的双稀土金属标记肽段也属于本专利技术的保护方法。
[0035]本专利技术合成的双稀土金属标记肽段可应用于高通量大规模的定量蛋白质组学研究中。
[0036]与现有技本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种双稀土金属标记肽段的合成方法，是使用两种相同或不同的稀土金属对C端带有赖氨酸的肽段进行标记；包括下述步骤：1)使用DOTA
‑
NHS
‑
ester试剂对目的肽段的N端氨基通过脱水缩合反应进行修饰，所述DOTA
‑
NHS
‑
ester的结构式如下式1所示：2)将稀土元素氯化物加入到步骤1)DOTA
‑
NHS
‑
ester修饰后的肽段溶液中，得到单稀土金属标记肽段；3)使用DOTA
‑
NHS
‑
ester试剂对步骤2)得到的单稀土金属标记肽段的C端赖氨酸通过脱水缩合反应进行修饰；4)将稀土元素氯化物加入到步骤3)制备的肽段溶液中，得到双稀土金属标记肽段。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述步骤1)中，所述反应的条件如下：肽段与DOTA
‑
NHS
‑
ester物质的量比为1:10
‑
1:1000，pH为9.0
‑
9.4，温度为4～37℃，时间为0.5～6h。3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于：所述步骤1)中，所述DOTA
‑
NHS
‑
ester溶于无水乙腈，配置成10mM
‑
50mM溶液；所述肽段溶于三乙胺
‑
碳酸缓冲溶液，配置成10mM
‑
50mM溶液；所述反应的反应体系中水与乙腈的体积比为1:1
‑
1:10。4.根据权利要求1
‑
3中任一项所述的方法，其特征在于：所述步骤2)中，所述反应的条件如下：DOTA
‑
NHS
‑
ester与稀土元素氯化物的物质的量比为1:1
‑
1:10，温度为4～37℃，时间为0.5～6h；或，所述步骤2)中，所述...

【专利技术属性】
技术研发人员：秦伟捷，孙浩帆，张万军，
申请(专利权)人：中国人民解放军军事科学院军事医学研究院，
类型：发明
国别省市：