巨噬细胞条件性基因敲除小鼠模型的建立及其应用制造技术

本发明专利技术公开了巨噬细胞条件性基因敲除小鼠模型的建立及其应用，属于生物技术领域。本发明专利技术首先通过构建巨噬细胞条件性Adar2基因敲除小鼠模型，发现巨噬细胞条件性Adar2基因敲除不会导致小鼠死亡，并且发现该模型能够通过促进肿瘤微环境中CD8

【技术实现步骤摘要】
巨噬细胞条件性基因敲除小鼠模型的建立及其应用


[0001]本专利技术涉及生物
，涉及一种改造的巨噬细胞在抗癌中的应用，通过促进肿瘤微环境中CD8
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T细胞的浸润和抑制肿瘤血管生成，从而增强抗肿瘤免疫与抑制肿瘤血管微环境，进而实现抑制肿瘤的良好治疗效果。

技术介绍

[0002]从常规治疗到免疫检查点免疫治疗，巨噬细胞在不同肿瘤治疗模式的有效性中起着双重作用。巨噬细胞是肿瘤微环境的重要组成部分，与癌细胞、基质和其他的免疫细胞进行复杂的相互作用，能调节炎症、组织的修复和肿瘤的进展等。在许多人类肿瘤中，巨噬细胞是T细胞检查点阻断的主要驱动因素，可介导免疫治疗的抵抗；适当激活时，巨噬细胞可以调控肿瘤细胞的吞噬和细胞毒性肿瘤杀伤，并与先天性和适应性免疫系统的组成部分进行有效的双向互作。因此聚焦巨噬细胞已成为癌症治疗中的切入点。目前免疫疗法的主要改造对象是T细胞，相比之下，另一类主要的免疫细胞——巨噬细胞似乎受到了冷落，但事实上我们发现，对巨噬细胞的工程化改造同样潜力巨大。
[0003]RNA编辑(RNA editing)是指真核细胞中对RNA分子在转录后进行再加工和修饰的过程。RNA编辑可以改变mRNA所编码蛋白质的功能活性，影响mRNA的稳定性，或参与非编码RNA加工成熟等一系列重要的生物学过程。RNA腺苷脱氨酶(Adenosine Deaminase Acting on RNA，ADARs) 家族，能识别特定双链RNA底物分子中的腺苷（A）并催化其水解脱氨成为肌苷（I），其中ADAR1主要负责ALU等重复序列的RNA编辑，ADAR2主要负责mRNA编码区的编辑，ADAR3不具有RNA编辑酶活性。由于I会被识别为G，因此A到I的RNA编辑在不改变基因组序列的情况下，时空特异性地增加了转录组和蛋白组的多样性。
[0004]ADAR2由ADARB1基因编码，又称为RED1，位于人类染色体21q22.3上，跨度约为152kb，是一种90kDa的核蛋白，两个双链RNA（dsRNA）结合结构域位于氨基末端，其两个氨基末端核定序列被importin α4（KPNA3）识别。相比于ADAR1在多种肿瘤中表达上调，并且发挥着促癌细胞增殖或者抗肿瘤免疫的作用。ADAR2则是在多种肿瘤组织中表达下调，目前仅有部分肿瘤类型中揭示了ADAR2的生物学功能，例如ADAR2过表达抑制胃癌、食管鳞癌和卵巢癌的增殖，ADAR2参与AKT介导的胶质瘤细胞的替莫唑胺耐药，其编辑酶活性抑制胶质瘤的增殖。胰岛β细胞中的ADAR2受抑制后可以削弱细胞膜电容变化，使细胞膜上胰岛素分泌囊泡数量降低。血管内皮ADAR2与急性心肌梗死中血管周围的免疫细胞浸润有关，但巨噬细胞中的ADAR2在肿瘤中发挥的生物学功能尚未阐明。生物信息学分析表明ADAR2与多种肿瘤浸润的淋巴细胞（自然杀伤细胞、记忆T细胞和嗜酸性粒细胞），免疫调节剂（KDR、CSF1R、CD160和TGFBR1）和趋化因子（CXCL12、CCL14、CXCL14和CCL21）存在显著正相关。越来越多的证据表明ADAR2与肿瘤及其微环境密切相关，但其在免疫调节中的作用，尤其是在巨噬细胞中的调控作用尚未明确。
[0005]Adar2全基因敲除小鼠会在出生后第0天到第20天之间死亡，并且在出生12天后进展性的癫痫发作，通过与Gria2的RNA编辑型小鼠杂交得到Adar2
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/
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Gria2
R/R
小鼠，可以避免
Adar2全基因敲除小鼠早期死亡。但目前未知巨噬细胞Adar2基因敲除小鼠模型对自身生长发育与机能反应产生何种影响。我们的研究发现巨噬细胞条件性Adar2基因敲除小鼠模型可以正常存活，并且皮下成瘤实验结果显示巨噬细胞条件性Adar2基因敲除可以有效的抑制小鼠的肿瘤负荷。因此探索巨噬细胞中的Adar2调控肿瘤发生发展的分子机制，以及针对巨噬细胞中的Adar2开发的肿瘤治疗方案有潜在的临床价值和广阔的应用前景。
[0006]由于伦理学限制，以及避免在人类进行试验所带来的风险，为了更深入的研究Adar2在巨噬细胞中的重要生物学功能，需要借助一定的动物模型来模拟人体的情况。对于肿瘤学和免疫学的功能研究，鉴于小鼠基因组93%的区域基因排列顺序与人类相同，且小鼠基因组改造的技术手段成熟，因此选择巨噬细胞条件性Adar2基因敲除小鼠进行动物模型构建，并通过肿瘤学和免疫学交叉结合的方式用于抗癌策略的研发。
[0007]目前没有巨噬细胞条件性Adar2基因敲除小鼠模型关于调控肿瘤微环境和用于肿瘤免疫治疗的相关报道。我们的研究发现巨噬细胞条件性Adar2基因敲除，通过增强抗肿瘤免疫与抑制肿瘤血管生成，可有效地抑制小鼠的肿瘤负荷。本研究通过一种新型的靶向巨噬细胞Adar2的免疫细胞疗法，应用于抗肿瘤治疗方案中，具有迫切的临床需求和广阔的应用前景。

技术实现思路

[0008]针对上述问题，本专利技术提供了一种改造的巨噬细胞在抗癌中的应用，通过特异性敲除巨噬细胞中Adar2改造巨噬细胞后，可促进CD8
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T细胞的浸润与阻碍肿瘤血管生成，显著抑制肿瘤的生长；通过建立巨噬细胞中特异性敲除Adar2基因的小鼠模型，将巨噬细胞进行改造后，小鼠可正常存活，小鼠皮下成瘤负荷实验显示，无需联用干扰素，即可明显地增强肿瘤微环境中CD8
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T细胞浸润的数量，促进抗肿瘤免疫，以及减少肿瘤血管的生成，进而抑制肿瘤生长。
[0009]为了实现上述目的，本专利技术提供了如下技术方案。
[0010]本专利技术提供了抑制巨噬细胞Adar2基因的试剂在制备肿瘤相关动物模型中的应用，其特征在于，所述巨噬细胞Adar2基因的试剂是通过基因敲除技术敲除巨噬细胞Adar2基因表达的试剂。
[0011]进一步地，所述巨噬细胞Adar2基因以外显子4作为条件敲除区。
[0012]进一步地，所述应用包括在肿瘤疾病发病机制的研究和肿瘤疾病药物筛选方面的应用。
[0013]进一步地，所述应用包括在促进抗肿瘤免疫、抑制肿瘤血管生成和抑制肿瘤生长方面的研究。
[0014]本专利技术还提供了一种巨噬细胞Adar2基因敲除小鼠模型的构建方法，其特征在于，所述方法基于基因敲除技术对C57BL/6小鼠的Adar2基因进行敲除，然后与Lyz2
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Cre工具鼠交配，最终构建出两种不同基因型的小鼠模型；所述两种不同基因型的小鼠模型包括Adar2
fl/fl
和Adar2
fl/fl
Lyz2
Cre
的小鼠模型；所述方法中敲除基因为Adar2基因外显子4作为条件敲除区。
[0015]本专利技术还提供了一种根据上述所述的巨噬细胞Adar2基因敲除小鼠模型在肿瘤疾病发病机制的研究中的应用。
[0016]本专利技术还提供了一种根据上述所述的巨噬细胞Adar2基因敲除小鼠模型在肿瘤疾病药物筛选方面的应用以及联用小分子药物、免疫检查点抑制剂的应用。
[0017]本发本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.抑制巨噬细胞Adar2基因的试剂在制备肿瘤相关动物模型中的应用，其特征在于，所述巨噬细胞Adar2基因的试剂是通过基因敲除技术敲除巨噬细胞Adar2基因表达的试剂。2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述巨噬细胞Adar2基因以外显子4作为条件敲除区。3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述应用包括在肿瘤疾病发病机制的研究和肿瘤疾病药物筛选方面的应用。4.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述应用包括在促进抗肿瘤免疫、抑制肿瘤血管生成和抑制肿瘤生长方面的研究。5.一种巨噬细胞Adar2基因敲除小鼠模型的构建方法，其特征在于，所述方法基于基因敲除技术对C57BL/6小鼠的Adar2基因进行敲除，然后与Lyz2
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Cre工具鼠交配，最终构建出两种不同基因型的小鼠模型；所述两种不同基因型的小鼠...

【专利技术属性】
技术研发人员：徐小燕，吴洁，张皓婉，张紫琪，张馨文，
申请(专利权)人：中国医科大学，
类型：发明
国别省市：