花生转录因子AhbHLH25基因及其应用制造技术

本发明专利技术公开了一种花生转录因子AhbHLH25基因及其应用，涉及生物工程的技术领域，其技术方案要点是，所述AhbHLH25基因开放阅读框为1176bp，共编码391个氨基酸；AhbHLH25基因的开放阅读框序列是序列表中SEQ ID No.1，所述AhbHLH25基因的氨基酸序列是序列表中SEQ ID No.2；将所述AhbHLH25基因通过转基因技术导入植物中，可以提高植物的耐盐性；通过病毒介导的基因沉默方法，在植物中降低所述花生转录因子AhbHLH25基因的表达，可以降低植株的耐盐性。性。

【技术实现步骤摘要】
花生转录因子AhbHLH25基因及其应用


[0001]本专利技术涉及生物工程
，更具体地说，它涉及一种花生转录因子AhbHLH25基因及其应用。

技术介绍

[0002]目前我国具有农业利用潜力的盐碱地面积近2亿亩，占国内耕地总面积的10％左右。国内外相关研究表明，筛选培育耐盐植物是改良、开发和利用盐碱地的有效途径。以山东省为例，山东省黄河三角洲地区有60.5万hm2左右的盐碱地，可以利用的中低产田近53.3万hm2。其中，全盐含量为0.1％～0.4％的中轻度盐碱地34.85万hm2。花生耐盐能力较强，具有成为盐碱土区农业结构优化调整的优良替代作物的潜力。筛选利用花生耐盐基因，培育耐盐花生新品种，使花生能够在盐渍化土壤中生长并达到一定的产量，是扩大花生种植面积，提高花生产量的有效手段。
[0003]转录因子是指能够与真核基因启动子区域中顺式作用元件发生特异性作用的DNA结合蛋白，通过它们之间以及与其它相关蛋白之间的相互作用，调控基因的表达。越来越多的研究表明，转录因子在植物抗逆响应中发挥重要作用。
[0004]bHLH是存在于真核生中最广泛的一类转录因子家族，也是植物中最大转录因子家族之一，可以通过与靶基因中特定的基序结合来调控基因的表达。该转录因子包含保守的bHLH结构域，由一个位于N端的碱性区域和一个位于C端的α螺旋结构组合而成。碱性区域是该转录因子与靶基因的识别区域，含有大量的碱性氨基酸，能与靶基因中保守的六核苷酸E
‑
box结合，调控它们的表达，行使生物学功能。在植物中，bHLH是仅次于MYB类的第二大转录因子家族，其家族成员广泛参与植物的新陈代谢、活性成分合成、金属离子内稳态以及信号激素调节等重要生物学过程，还在植物的生长发育和环境应激中扮演着重要角色。到目前为止，尚未发现花生中bHLH25基因的研究报道。

技术实现思路

[0005]针对现有技术存在的不足，本专利技术的第一个目的在于提供一种花生转录因子AhbHLH25基因。
[0006]为实现上述第一个目的，本专利技术提供了如下技术方案：一种花生转录因子AhbHLH25基因，所述AhbHLH25基因开放阅读框为1176bp，共编码391个氨基酸。
[0007]进一步地，所述AhbHLH25基因的开放阅读框序列是序列表中SEQ ID No.1，所述AhbHLH25基因的氨基酸序列是序列表中SEQ ID No.2。
[0008]进一步地，扩增所述AhbHLH25基因全长开放阅读框所用引物为：
[0009]AhbHLH25
‑
F1：5
’‑
ATGCTAGTTGGTGAAGATCAACAC
‑3’
；
[0010]AhbHLH10
‑
R1：5
’‑
TCACATGAAAGTTGAAAACGCTGAAC
‑3’
；
[0011]扩增条件为：
[0012]全长开放阅读框PCR扩增反应体系包含10μL Buffer、4μL dNTP、1μL GXL、2μL总
cDNA、1.5μL AhbHLH25
‑
F1、AhbHLH25
‑
R1和30μL无菌双蒸水；全长PCR扩增反应条件如下：(a)98℃，20S；(b)58℃，25S；共35cycles；(c)72℃，10min。
[0013]本专利技术的第二个目的在于提供一种花生转录因子AhbHLH25基因的应用，将所述AhbHLH25基因通过转基因技术导入植物中，可以提高植物的耐盐性。
[0014]进一步地，通过病毒介导的基因沉默方法，在植物中降低所述花生转录因子AhbHLH25基因的表达，可以降低植株的耐盐性。
[0015]进一步地，AhbHLH25基因荧光定量RT
‑
PCR所用的引物序列为：
[0016]AhbHLH25
‑
F
‑
RT：5
’
CTAAGGTTGAGATTATGAGTAG
‑3’
[0017]AhbHLH25
‑
R
‑
RT：5
’‑
ATGAGGTTGATGAGAAGAA
‑3’
；
[0018]进一步地，荧光定量RT
‑
PCR条件为：
[0019]荧光定量RT
‑
PCR所用cDNA模板稀释到8ng/μL，使用的聚合酶是SYBR Green，每反应体系加1.5μL稀释的cDNA；
[0020]RT
‑
PCR反应程序为：(a)90℃，15s；(b)95℃，5s；(c)60℃，40s；(d)72℃，15s；35个循环。
[0021]综上所述，本专利技术具有以下有益效果：
[0022]1、本专利技术公开了一种花生转录因子AhbHLH25基因，该基因在盐胁迫处理后相对表达量一直处于上升趋势，表明该基因在花生对盐胁迫的适应性中具有重要作用。
[0023]2、本专利技术公开的花生转录因子AhbHLH25基因，通过转基因手段导入拟南芥中，在盐胁迫状态下，野生型拟南芥植株叶片瘦小、植株萎缩，而转基因拟南芥植株叶片厚实、植株壮大、生命力旺盛，转基因植株具有明显的耐盐表型，且转基因植株MDA含量平均为野生型植株的85％，SOD、POD、CAT含量分别为野生型植株的122％、175％和196％，从而说明转基因植株的耐盐性显著高于野生型植株。该基因沉默后盐胁迫处理花生植株，发现基因沉默植株叶片枯萎程度显著高于野生型植株。以上说明AhbHLH25基因具有显著的耐盐性，进而AhbHLH25基因能提高花生的耐盐性，增强花生的抗逆性。
附图说明
[0024]图1是花生AhbHLH25基因的琼脂糖凝胶电泳图谱，其中，M：marker，1:阴性对照；2和3：AhbHLH25基因；
[0025]图2是花生AhbHLH25基因在盐胁迫下的表达模式分析；
[0026]图3是拟南芥过表达AhbHLH25基因在盐胁迫下的表型；
[0027]图4是转基因拟南芥盐胁迫关键生理指标；
[0028]图5是基因沉默植株在盐胁迫下的表型。
具体实施方式
[0029]以下结合实施例对本专利技术作进一步详细说明，但并不是对本专利技术的进一步限定。
[0030]实施例1花生转录因子AhbHLH25基因的克隆
[0031]S1、材料的准备与处理，包括花生种子的萌发、生长以及盐胁迫处理。
[0032]材料选择花生品种花育6302，种子在Hoagland培养液中培养萌发，萌发及幼苗生长条件为14h光照/10h黑暗，温度为25
‑
28℃，幼苗生长14天用于盐胁迫处理；盐胁迫用氯化
钠处理，花生根浸泡在150mM氯化钠溶液中，在处理48h内取花生的叶片作为材料，所有材料均保存于
‑
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【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种花生转录因子AhbHLH25基因，其特征在于，所述AhbHLH25基因开放阅读框为1176bp，共编码391个氨基酸。2.根据权利要求1所述的花生转录因子AhbHLH25基因，其特征在于，所述AhbHLH25基因的开放阅读框序列是序列表中SEQ ID No.1，所述AhbHLH25基因的氨基酸序列是序列表中SEQ ID No.2。3.根据权利要求1所述的花生转录因子AhbHLH25基因，其特征在于，扩增所述AhbHLH25基因全长开放阅读框所用引物为：AhbHLH25
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F1：5
’‑
ATGCTAGTTGGTGAAGATCAACAC
‑3’
；AhbHLH10
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R1：5
’‑
TCACATGAAAGTTGAAAACGCTGAAC
‑3’
；扩增条件为：全长开放阅读框PCR扩增反应体系包含10μL Buffer、4μL dNTP、1μL GXL、2μL总cDNA、1.5μL AhbHLH25
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F1、AhbHLH25
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R1和30μL无菌双蒸水；全长PCR扩增反应条件如下：(a)98℃，20S；(b)58℃，25S；共35cycles；(c)72℃，10min。4.一种花生转录因子AhbHLH25基因的应用，其特征在于，将所述...

【专利技术属性】
技术研发人员：赵小波，单世华，王奇，李春娟，闫彩霞，孙全喜，王娟，牟艺菲，苑翠玲，
申请(专利权)人：山东省花生研究所，
类型：发明
国别省市：