本发明专利技术提供了一种提高豆科作物产量的大豆突变基因及其应用。该基因由大豆POD基因（Glyma.08G055900）核苷酸序列中至少一个核苷酸发生突变后获得，其核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。本发明专利技术以大豆POD基因（Glyma.08G055900）为模板，通过CRISPR/Cas9基因编辑技术获得一种POD突变基因。将此突变基因转入大豆细胞，能获得豆荚数目和单株产量显著提高的转基因大豆，改善大豆产量相关性状，为大豆育种提供了更加有效的技术手段。为大豆育种提供了更加有效的技术手段。为大豆育种提供了更加有效的技术手段。
【技术实现步骤摘要】
一种提高豆科作物产量的大豆突变基因及其应用
[0001]本专利技术属于分子生物学和基因工程领域，具体涉及一种提高豆科作物产量的大豆突变基因及其应用。
技术介绍
[0002]大豆作为一种优良植物蛋白来源，可以补充人体所必需的多种氨基酸；同时大豆还富含对人体有益的异黄酮、皂苷、卵磷脂和可溶性纤维，通过提高免疫力、降低血管胆固醇、预防心血管疾病、促进胃肠蠕动。
[0003]大豆单产是由单位面积的有效株数和单株产量构成的，单株产量又受株高、主茎节数、分枝数、单株荚数、单荚粒数、单株籽粒数、百粒重以及开花期、成熟期等影响。这些与产量相关的性状都属于复杂的多基因或多QTL位点控制的数量性状，且易受环境条件的影响，迄今为止，控制大豆产量的关键基因克隆的成功案例还比较少。单株荚数是决定单株产量的一个关键决定因子，因此培育大豆豆荚数目较多的品种是大豆育种的目标之一。目前国内外研究已经定位了约70个大豆荚数QTL，这些QTL几乎分布于在大豆每一条染色体上，绝大多数的贡献率在20%以下，只有几个在20%以上。但是，有关控制大豆豆荚数目的关键基因克隆尚未见报道。
技术实现思路
[0004]为了解决上述的技术问题，提高大豆单株豆荚数、单株籽粒数和单株产量及大豆产量，本专利技术提供以下技术方案。
[0005]第一方面，本专利技术提供一种大豆突变基因，所述大豆突变基因由大豆POD基因（Glyma.08G055900）核苷酸序列中至少一个核苷酸发生突变后获得。
[0006]优选地，所述Glyma.08G055900的序列如SEQ ID NO:2所示。
[0007]优选地，所述突变为核苷酸插入、缺失、重复以及单个碱基的点突变。
[0008]优选地，所述突变为核苷酸缺失。
[0009]优选地，所述核苷酸缺失为所述大豆POD基因起始密码子下游92bp处发生连续3个碱基缺失，并导致大豆POD蛋白质的第31位的脯氨酸缺失。
[0010]优选地，所述碱基缺失C和A 的缺失，具体为CAA缺失。
[0011]优选地，该大豆突变基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。
[0012]第二方面，本专利技术提供第一方面所述的大豆突变基因在提高豆科作物产量中的应用。
[0013]优选地，所述提高豆科作物产量为提高单株荚数、单株籽粒数和单株产量。
[0014]第三方面，本专利技术提供一种重组载体及其在提高豆科作物产量中的应用，其含有第一方面所述的大豆突变基因。
[0015]优选地，所述重组载体为pGmEF1A2:SpCas9。
[0016]第四方面，本专利技术提供一种重组基因工程菌及其在提高豆科作物产量中的应用，
所述重组基因工程菌含有第一方面所述的大豆突变基因。
[0017]优选地，所述重组基因工程菌采用第三方面的重组载体转化得到。
[0018]优选地，所述重组基因工程菌为农杆菌EHA105。
[0019]第五方面，本专利技术提供一种转基因细胞及其在提高豆科作物产量中的应用，所述转基因细胞含有第一方面所述的大豆突变基因。
[0020]优选地，所述转基因细胞为双子叶植物转基因细胞。
[0021]优选地，所述双子叶植物包括大豆、花生、鹰嘴豆、菜豆、赤小豆、苜蓿、棉花、葡萄、樱桃、薄壳山核桃或橙子。进一步优选为大豆，更优选为大豆HC6。
[0022]第六方面，本专利技术提供第一方面所述的大豆突变基因、第三方面所述的重组载体、第四方面所述的重组基因工程菌或第五方面所述的转基因细胞在双子叶植物分子育种或基因编辑中的应用。
[0023]优选地，所述的应用包括将第一方面所述的大豆突变基因、第三方面所述的重组载体或第四方面所述的重组基因工程菌转入所述双子叶植物并表达POD同源蛋白的步骤。
[0024]优选地，所述双子叶植物包括大豆、花生、鹰嘴豆、菜豆、赤小豆、苜蓿、棉花、葡萄、樱桃、薄壳山核桃或橙子。进一步优选为大豆，更优选为大豆HC6。
[0025]本专利技术的有益效果：一、本专利技术以大豆POD基因Glyma.08G055900（SEQ ID NO:2）为模板，通过CRISPR/Cas9基因编辑技术获得一种大豆POD突变基因（SEQ ID NO:1）。
[0026]二、本专利技术将获得的大豆POD突变基因转入大豆细胞，并获得了单株荚数、单株籽粒数和和单株产量显著提高的转基因大豆，改善了大豆产量相关性状。并且为大豆育种提供了更加有效的技术手段。
附图说明
[0027]图1所示为POD基因编辑载体验证结果；图2所示为POD基因编辑载体图谱；图3所示为KO
‑
POD双靶点敲除载体质粒转化EHA105农杆菌菌落PCR电泳检测结果；图4所示为POD突变体大豆的基本信息；图5所示为POD基因在大豆各个组织中的表达量分析；图6所示为POD同源蛋白在双子叶植物中保守性分析。
具体实施方式
[0028]下面结合实施例和附图来进一步描述本专利技术的技术方案，本专利技术的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但是应当理解，实施例仅是示例性的，不对本专利技术的范围构成限制。
[0029]需要说明的是，下述实施例中所用实验方法如无特别说明，均为本领域常规方法。
[0030]实施例1、靶向大豆POD基因的特异性sgRNA设计。
[0031]以大豆优良品种HC6的POD基因CDS序列（SEQ ID NO:2中第369
‑
3500位）为参考，利用CRISPR RGEN Tools分别设计两个特异性靶向POD基因的sgRNA。其中，sgRNA1（TTCTTGGGCTTTCTTGGAT(SEQ ID NO:3)，SEQ ID NO:2 第457
‑
475位的反向互补序列），相应
位点PAM序列为TGG，sgRNA2（TTGTTATGACATGGTGCGC(SEQ ID NO:4)，SEQ ID NO:2 第572
‑
590位序列），相应位点PAM序列为AGG。
[0032]实施例2、大豆POD基因双靶点敲除载体的构建。
[0033]利用限制性内切酶Bsa I
‑
HF使中间载体GmpUC19
‑
1和GmpUC19
‑
2线性化，结果见图1中的A。将靶点引物KO
‑
POD
‑
sg1F（GGATTGTTCTTGGGCTTTCTTGGAT，SEQ ID NO:5）/sg1R（AAACATCCAAGAAAGCCCAAGAACA，SEQ ID NO:6）和KO
‑
POD
‑
sg2F（GGATTGTTGTTATGACATGGTGCGC，SEQ ID NO:7）/sg2R（AAACGCGCACCATGTCATAACAACA，SEQ ID NO:8）分别退火形成dsDNA，利用T4 DNA连接酶分别将sgRNA1靶点退火产物与GmpUC19
...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
1.一种大豆突变基因，其特征在于：所述大豆突变基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。2.权利要求1所述的大豆突变基因在提高豆科作物产量中的应用，其特征在于：所述提高豆科作物产量包括提高单株荚数、单株籽粒数和单株产量。3.一种重组载体在提高豆科作物产量中的应用，其特征在于：所述重组载体含有权利要求1所述的大豆突变基因。4.一种转基因细胞在提高豆科作物产量中的应用，...
【专利技术属性】
技术研发人员：朱友林，王东，杨荣新，蒋丽芸，钟丽梅，贺热情，阎新，刘金龙，
申请(专利权)人：南昌大学，
类型：发明
国别省市：
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